分子生物学实验技术实验内容

1、2006 年分子生物学实验技术实验内容 一、RT-PCR （一）总 RNA 的提取 实验安排： 每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： 1、将 100l 液体样品加入 1.5ml Ep 管中，再加入 900l 冰预冷的 LS-BiotragentsTM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物） 。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置 5min。 3、加入 200l 氯仿，颠倒 Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和 10s。 4、在 4条件下，以 10000 g 离心 15min。 5、将上层水相转移到一个新的 Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后

2、在 4放置至少 10min。 6、在 4条件下，以 10000 g 离心 15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用 1ml 75%乙醇洗涤 RNA 沉淀和管壁。 8、 将 RNA 沉淀进行干燥 （不能完全干燥） 处理后， 用 10l 无 RNase 污染的水 （RNase-Free Water）将 RNA 溶解并于-20保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于 180的高温下干烤 6hr 或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用 0.1% DEPC 水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用 0.1% DEPC，在 37处理 12hr 以上。然后用高压灭菌除

3、去残留的 DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用 DEPC 处理过的无菌双蒸水配制，然后经 0.22m滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 （二）反转录 实验安排： 每人做一管。 反应体系（20l） ：按下列顺序加样 反应条件：42 1h 注意事项： 1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。如在一般的 PCR 反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。 2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。 3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。 4、酶类试剂应放

4、置在冰盒上取用，用完后立即放回-20，以防酶失活。 （三）PCR 实验安排： 每人做一管。 反应体系（50l） ：按下列顺序加样 5 Buffer 4l dNTPs 6l RNA 酶抑制剂 1l Oligo（dT） 1l 随机引物 1l 反转录酶 AMV 1l 提取的 RNA 6l 总体积总体积 20l ddH2O 32.7l 10 PCR Buffer 5l dNTPs 4l P1 2l P2 2l Taq 0.3l cDNA template 4l Total 50l 反应程序： 预变性 94 2min 变性 94 30s 退火 50 45s 延伸 72 1min 30 cycles 终延

5、伸 72 10min PCR 产物的检测：琼脂糖凝胶电泳 1、电泳缓冲液 TBE(10)的配制： 称取 Tris-base 54g，硼酸 27.5g，并加入 0.5M EDTA(pH8.0) 20ml，定溶至 1000ml。 2、1.5%琼脂糖凝胶的配制： 称取 1.5g 琼脂糖于三角瓶中，加入 10ml 10TBE 缓冲液，并加水定容至 100ml，加热溶解后加入 5l EB(10mg/ml)，摇匀后倒入插有梳子的电泳槽，待其凝固后拔去梳子即可用于电泳。 3、电泳检测： 取 PCR 产物 5l 与 Loading Buffer 1l 混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样品孔旁加入 5l

6、DL2000 DNA Marker 作对照，以 100V 电压，50mA 电流进行电泳，约15min 后于紫外灯下观察结果。 注意事项： 1、EB 有致癌性，电泳操作需戴手套进行。 2、禁止将盛有 EB 的器皿随意乱放，且不要戴有 EB 污染的手套随意拿其它无 EB 的试剂或仪器。 （四）PCR 产物的纯化 实验安排： 每两人的 PCR 产物合并后作为一管，用 PCR 产物回收试剂盒（E.Z.N.A. Gel Extraction Kit）回收目的 DNA。 操作步骤： 1、PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下凝胶中含目的条带的胶粒，放入预先称好重量的空 1.5ml Ep 管中。 2

7、、将装有胶粒的 Ep 管放在电子天平上再次称重，计算胶粒的重量。 3、按 1g 胶加 1ml 的量加入 Binding Buffer，置于 5565水浴中约 7min，其间要摇动 Ep 管 23 次，使胶粒完全溶解。 4、将上述溶胶液加入到 HiBind spin-column 中，10000g 离心 1min，弃去收集管中的液体。 5、加入 300l Binding Buffer，10000g 离心 1min，弃去收集管中的液体。 6、加入 750l SPW Buffer，静置 2min，10000g 离心 1min，弃去收集管中的液体。 7、重复步骤 6。 8、空管 10000 g 离心

8、1min，以弃去 DNA 回收柱中的残余液体。 9、将 DNA回收柱放入新的 1.5ml Ep 管中， 并加入 30l DNA Elution Buffer 至膜的中央，10000 g 离心 1min，以收集纯化的 DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测后于20保存。 注意事项： 1、电泳时应换用新配制的 TBE buffer，否则会由于电泳缓冲液 pH 升高而降低 DNA 的产量。 2、在切下含目的 DNA 的凝胶时， 要衬以干净的塑料薄膜 （如一次性手套） ， 使用无 DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源 DNA 的污染。 3、切胶过程要尽可能短，防止 DNA 在紫外线下长时间暴露引起突变，且要把

9、含有目的DNA 的胶块尽可能小的切下，以利于后续步骤的进行。 4、DNA 的洗脱效率与 Elution Buffer 的 pH 有关，因此用 ddH2O 洗脱 DNA 时，应调节ddH2O 的 pH 值至 8.0。 二、基因的克隆 （一）DNA 片断与载体的连接 本实验做 PCR 回收产物与 pMD-18T 载体的连接， 应用 TaKaRa 公司的试剂盒进行。 TA 克隆原理： 利用 Taq 酶能够在 PCR 产物的 3末端加上一个非模板依赖的 A，而 T 载体是一种带有 3T 突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把 PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中，主要

10、用于 PCR 产物的克隆和测序。 实验安排： 每两人做一管。 反应体系（10l） ： Ligation Solution I 5l PCR 回收产物 4.5l pMD-18T vector 0.5l 总体积 10l 反应条件：16 4h 以上 （二）感受态细胞的制备 实验安排： 每人做一管。 试剂配制： 1、LB 液体培养基(Luria-Bertani)： 称取蛋白胨(Tryptone) 10g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于 800ml 去离子水中，用 NaOH 调 pH 至 7.5, 加去离子水至总体积 1 升,高压下蒸气灭菌 20 分钟。 2、0.

11、1mol/L CaCl2溶液： 称取 1.11g CaCl2(无水，分析纯)，溶于超纯水中，定容至 100ml，高压灭菌或 0.22m滤膜过滤除菌。 3、无菌甘油： 取甘油 100ml，高压灭菌即可。 操作步骤（无菌操作） ： 1、从生长有大肠杆菌 DH5 的平板上挑取一个单菌落，接种于 2ml LB 液体培养基中，37 200r/min 振荡培养过夜，作为一级种子。 2、将一级种子按 1:50 比例无菌转接到 5ml LB 液体培养基中， 37 200r/min 振荡培养约 2h-3h，至细菌的 OD600达到 0.5 左右。 3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的 1.5ml Ep 管中，

12、冰浴 30min。 4、4 4000 r/min 离心 10min，弃上清。 5、加入 1ml 冰预冷的 0.1mol/L CaCl2重悬沉淀，继续冰浴 15min30min。 6、4 4000 r/min 离心 10min，弃上清。 7、沉淀中加入 200l 用冰预冷的 0.1mol/L CaCl2轻轻重悬。 悬浮的感受态细胞可直接用于转化，若要保存，则需加入无菌甘油至终浓度为 15%，分装 100l/管，-70保存备用。 注意事项： 1、细胞生长状态：不要用经过多次转接或储存于 4的培养菌，最好从-70或-20甘油保存的菌种中取适量在 LB 固体培养基上划线培养，作为制备感受态细胞的菌种。

13、 2、细胞生长密度：以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的 OD600来控制。DH5 菌株的 OD600为 0.5，细胞密度在 5107个/ml 左右(不同菌株情况有所不同)时比较合适。密度过高或不足均会影响感受态细胞的转化效率。 3、试剂的质量：所用的试剂，如 CaCl2等均需是高纯度的(AR.)，并用超纯水配制，最好于-20分装保存。 （三）连接产物的转化 实验安排： 每人做一份。 试剂配制： 1、氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液： 用灭菌的 ddH2O 将氨苄青霉素粉配成 100mg/ml 水溶液，经 0.22m 滤膜过滤除菌后，置-20保存备用。 2、LB 液体培

14、养基（Amp） ： 在 LB 液体培养基中加入 1l 100mg/ml 的氨苄青霉素母液后混匀即可，一般现配现用。 3、LB 固体培养基（Amp） ： 在 LB 液体培养基中加入 1.5%的琼脂粉，15 磅高压蒸气灭菌 20min。待培养基温度降至 50左右，加入 1l 100mg/ml 的氨苄青霉素母液后，铺制平板。待培养基凝固后，于 4保存备用。 操作步骤： 1、取-70冻存的感受态细胞于冰上融化后， 加入连接产物 5 l， 轻轻混匀， 冰浴 30min。 2、42水浴热激 90sec，再迅速放回冰上 2min。 3、加入 400 l LB 液体培养基，37 200r/min-220r/m

15、in 振荡培养 45min 后，以恢复质粒的抗性。 4、4 4000r/min 离心 5min，弃去上清 400 l，将剩余的 100 l 菌液混匀后涂氨苄平板，37培养 30min（平皿正放） ，待菌液吸收完全，再将平皿倒置培养约 12h16h，至单菌落出现。 注意事项： 1、质粒的浓度：转化效率与外源 DNA 的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA 的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。一般情况下，DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5%。 2、在感受态细胞中加入连接产物后应轻轻混匀，避免使细胞破裂。 3、同时应做两个对照，以检验氨苄青霉素的抗性和感受态细胞的质量。 对照

16、组 1：以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，其它操作同上，此组正常情况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现。 对照组 2： 以质粒代替 DNA 溶液， 其它操作同上， 此组正常情况下在含抗生素的 LB平板上应出现大量菌落。 （四）质粒的抽提 实验安排： 每人抽提一管，采用质粒快速提取试剂盒进行。 实验原理： 本试剂盒所带 Resin 质子化以后，具有在高盐、低 pH 值情况下吸附DNA，在低盐、高 pH 值情况下释放 DNA 的性质。 试剂组成： 1、离心柱(50个)：柱上含Resin(树脂)，最大吸附量15 g，4保存。 2、溶液A(0.6m1)：RNase A 10mg/m1，-

17、20保存。 3、溶液B(9m1)：50mM Tris/HCl，10mM EDTA，10mg/m1溶菌 酶，pH 8.0，4保存。 4、溶液C(18m1)：1SDS，0.2M NaOH(室温低于15时会有沉淀析出，加热溶解即可)。 5、溶液D(24m1)：4M盐酸胍，0.75M KAc pH4.6。 6、溶液E(12ml)：洗液(用时加入96m1无水乙醇，充分混匀)。 7、溶液F(12ml)：洗液(用时加入96ml无水乙醇，充分混匀 )。 8、溶液G (5ml)：TE缓冲液(10mM Tris/HCl，1mM EDTA，pH8.0)，4保存。 操作步骤： 1、用灭菌牙签挑取单菌落于 5ml 含氨

18、苄青霉素的 LB 液体培养基中 12h16h。 2、用 1.5m1 离心管收集 3ml-5ml 菌液， 15000r/min 离心 30s， 弃尽上清。 （注：在 1.5ml 离心管中加入 1.5ml 菌液，离心收集菌体，弃上清后再加入 1.5ml菌液，收集菌体，如此反复。） 3、加入150l溶液B，10l溶液A，充分振荡悬浮，室温放置5min。（注：悬浮细菌，消化RNA，若RNA含量很大，则消化时间可以延长。） 4、加入300l溶液C，温和反复颠倒混匀4-6次，室温放置5min。（注：混匀时用力不宜过度，看到溶液变粘即可。） 5、加入450l溶液D，反复颠倒混匀4-6次。（注：此时可见白色絮

19、状物，颠倒力度可以比上步稍剧烈。） 6、12000r/min离心5min，去沉淀。 7、将上清置于离心柱中，静置2min。（注：此时离心柱置于2ml离心管中。） 8、8000r/min离心30s，弃掉收集管中的液体。（注：此时DNA被吸附于离心柱中的Resin上。） 9、加入500l溶液E，8000r/min离心30s，弃掉收集管中的液体。（注：目的是将Resin上吸附的蛋白质、盐等杂质洗脱。） 10、加入500l溶液F，8000r/min离心30s，弃掉收集管中的液体。 11、12000r/min再次离心1min，以甩干剩余液体。（注：主要是去掉残余酒精，以利DNA溶解。） 12、将离心管柱

20、置于新的1.5mlEp管中，室温敞开离心管盖放置5-10min，加入30l50l溶液G(50预热)保温5min，12000r/min离心1min，管底即为质粒DNA。（注：溶液G可用无菌双蒸水代替，加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。50预热，目的是提高产量，温度不需很准，50一65均可。） 13、0.8%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。 注意事项： 1、细 菌培养 不要 超过 16小时 ，否则 细菌会 崩解 ，引起 细菌 大量 死亡 ，导致质粒丢失。 2、抗 生素浓 度要 正确， 确保 大肠杆 菌 中含 有目 的质粒 ，具 体浓 度可 参看各类工具书。 3、电泳若显示有残余RNA，则

21、可延长“3”步消化时间。 4、若发现有染色体DNA(大分子DNA)污 染，则可能是菌体太 多或 “4”步振荡过于剧烈，使染色体DNA被打断。 5、 此 方 法 提 取 DNA质 量 非 常 高 ， 适 用 于 分 子 生 物 学 任 何 实 验 要 求 ，OD260/OD2801.5，一般情况能达到1.71.8，若比值偏低，可能是菌体密度太高所致，可适当减少振摇时间。此质粒若用来测序，可将第 9、第10步各重复一遍，质粒的质量会更高。 6、此试剂盒最大收率为15g，具体产量视菌量、质粒性质而定。 （五）重组质粒的酶切鉴定 实验安排： 每人做一管。 反应体系（20l） ： 重组质粒 5l 10B

22、uffer 2l BamH 0.5l EcoR 0.5l ddH2O 12 总体积 20l 反应条件：37 3h 以上 结果检测： 取酶切产物 10l 与 2l Loading Buffer 混合后，用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，同时设DL15000 DNA Marker 作对照。 注意事项： 1、酶切时所加的 DNA 溶液体积不能太大，否则 DNA 溶液中其他成分会干扰酶反应。 2、反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 3、酶通常保存在 50%的甘油中，实验中应将反应液中甘油浓度控制在 1/10 之下，否则，酶的活性将会受到影响。 4、紫外光对 D

23、NA 分子有切割作用，因此从胶上回收 DNA 时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm） ，以减少紫外光切割 DNA。 5、EB 是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把 EB 洒到桌面或地面上。凡是沾污了 EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。 三、外源基因在大肠杆菌中的表达 （一）含有表达质粒的重组细菌的诱导表达 实验安排： 每组做一份（6 人/组） 。 操作步骤： 1、将重组质粒和对照载体分别转化 BL21(DE3)感受态细胞，待长出菌落后在转化的平皿中各挑取一个单菌落接种于 3ml 含 Amp 的 LB 液体培养基中，37培养过夜。 2

24、、将培养的细菌按 150 比例加入到 5ml 含 Amp 的新鲜 LB 液体培养基中，37振荡培养至 OD6000.4-1.0（最好 0.6，大约需 3h） 。 3、取 1ml 菌液作为未诱导的对照组，余下的加入 IPTG 诱导剂至终浓度为 0.5mM 作为实验组，两组继续 37振荡培养 3h。 4、分别取菌液 1ml 于 1.5ml Ep 管中，12000g 离心 30s，收获菌体。 5、用 100l 无菌去离子水将菌体吹散混匀，然后加 100 l 2SDS 凝胶加样缓冲液，混匀后沸水浴 5min。 6、通过 SDS-PAGE 电泳检测外源蛋白的表达情况。 注意事项： 1、IPTG 的最佳诱

25、导浓度的确定：将 IPTG 以不同浓度（0.22.0mM）加入菌液中进行诱导，通过 SDS-PAGE 电泳检测外源蛋白的表达情况，选择外源蛋白表达量最高时的 IPTG 浓度作为其最佳诱导浓度。 2、最佳诱导时间的选择：在菌液中加入最佳浓度的 IPTG 诱导 6h，其间每隔 1h（在第1h、2h、3h、4h、5h、6h）分别取菌液 1ml，通过 SDS-PAGE 电泳检测外源蛋白的表达情况，选择外源蛋白表达量最高时的诱导时间作为其最佳诱导时间。 （二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 实验安排： 示范性操作。 实验原理： 细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂

26、 SDS 与某一还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇 DTT）并用，通过加热使蛋白质解离，大量的 SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。 试剂配制： 1、30%丙烯酰胺贮存液： 丙烯酰胺 29.2g， 亚甲双丙烯酰胺 0.8g， 混匀后加 ddH2O， 37溶解， 定容至 100ml，棕色瓶存于 4。 2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0)： Tris base 18.17g 加 ddH2O 溶解，浓盐酸调 pH 至

27、8.0，定容至 100ml，4保存。 3、1M Tris-HCl(pH 6.8)： Tris base12.11g 加 ddH2O 溶解, 浓盐酸调 pH 至 6.8，定容至 100ml，4保存。 4、10% SDS： 电泳级 SDS 10.0 g 加 ddH2O 68助溶，浓盐酸调至 pH 7.2，定容至 100ml。 5、电泳缓冲液(pH 8.3)： Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml 加 ddH2O 溶解，定容至 1000ml。 6、10%过硫酸铵（AP） ： 1g 过硫酸铵加 ddH2O 至 10ml。 7、2SDS 电泳上样缓冲液： 1M Tris

28、-HCl (pH 6.8) 1.0ml，-巯基乙醇 1.0ml，SDS 0.4 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚蓝 1.0ml，ddH2O 5.0ml。 8、考马斯亮蓝染色液： 考马斯亮蓝 R250 0.25 g，甲醇 45ml，冰醋酸 10ml，ddH2O 45ml。 9、脱色液： 甲醇 45ml，冰醋酸 10ml，ddH2O 45ml。 操作步骤： 采用垂直式电泳槽装置 1、安装电泳槽 2、配制分离胶(12%)（10ml） ： ddH2O 3.3ml 30%丙烯酰胺贮存胶 4.0ml 1.5M Tris-HCl 2.5ml 10% SDS 0.1ml 10% AP 0.1ml TEMED

29、 4.0l 混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面水平。 （凝胶完全聚合需 30-60min） 。 3、配制积层胶（5%） （3ml） ： ddH2O 2.1 ml 30%丙烯酰胺贮存胶 0.5 ml 1M Tris-HCl 0.38 ml 10%SDS 0.03 ml 10%AP 0.03 ml TEMED 3.0 l 将分离胶上的水倒去，并用滤纸吸干多余水份，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需 15-30min。 4、待积层胶完全聚合后，小心拔出梳子，然后将玻璃板固定在电泳槽上。 5、样品处理：将样品加入等量的 2 SDS 上样缓冲液，100加热 3-5min， 1200

30、0g 离心1min，取上清作 SDS-PAGE 分析，同时将 SDS 低分子量蛋白质 Marker 作平行处理。 6、上样：取 10l 诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中，并加入 20l 低分子量蛋白 Marker 作对照。 7、电泳：在电泳槽中加入 1电泳缓冲液，连接电源，电泳时，积层胶电压 80V，分离胶电压 120V，电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端停止（约需 2-3h） 。 8、染色：将胶从玻璃板中取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色，室温 4-6h。 9、脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。 10、凝胶摄像和保存：将脱色好的凝胶摄像，凝胶可保存于双蒸水中或 7%乙

31、酸溶液中。 注意事项： 1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。 2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的 pH 值要准确，10%AP 在一周内使用。室温较低时，TEMED 的量可加倍。 3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。 （三）Western Blot 实验安排： 示范性操作。 实验原理： Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测；对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与 Southern 或 Northern 杂交方法类似，但 We

32、stern Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质， “探针”是抗体， “显色”用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 试剂准备： 1、SDS-PAGE 试剂：见电泳实验。 2、 匀浆缓冲液： 1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.0ml， 10%SDS 6.0ml， -巯基乙醇 0.