梨醋饮项目初期试验方案

1、12主要试剂及溶液斐林溶液，甲基兰指示液，氢氧化钠标准溶液0.05mol/l，酚酞指示液；偏重亚硫酸钾 分析纯果胶酶 诺维信 比活力1.6万u/ml（晚晴可能有）葡萄糖 、柠檬酸分析纯、维生素c1.3主要仪器csioi一a型电热鼓风干燥箱雷磁phs一3c型酸度计7230g型分光光度计双目光学显微镜:上光六厂超净工作台:江苏安泰空气技术有限公司台式高速离心机:上海安亭科学仪器厂bsa124s型电子天平:北京赛多利斯有限公司高压蒸汽灭菌器: hh一型数显恒温水浴锅:浙江金坛市富华仪器有限公司1.4测定与分析酒精度:按gb/t 15038-2006方法执行（选用50ml附温比重瓶、有针对性改进）总糖

2、和还原搪:快速斐林法可溶性固形物:手持折光仪测定总酸度:氢氧化钠滴定法（取1.5ml样品，0.1mol/l氢氧化钠滴定液）挥发酸：水蒸气蒸馏法酵母菌数:血球计数板法so2测定:直接碘量法ph值测定:数字酸度计梨汁澄清度的测定:605nm波长测定梨酒澄清度测定:680nm波长测定梨汁、梨酒、梨醋成分测定：gc-ms法梨果饮有效成分含量测定：hplc法（需购买反相c18柱1支，约1000元）矿物质含量测定：原子吸收法（较复杂，需联系相关实验室）2实验内容及方法2.1梨酒加工工艺流程：2.2果汁制备调整2.21果汁制备（采用澄清汁发酵，客户已完成）：2.2.2果汁so2处理（50100mg/l质量浓

3、度）添加有效量为50%的偏重亚硫酸钾(87-173mg/l)至设定so2浓度?怎么换算，充分混匀，静置24h。2.2.3果汁的澄清用果胶酶对梨汁进行澄清处理,称取果胶酶粉剂放入烧杯中，用适量温水稀释成l%的酶液?配多少酶液，放置l-2h后，放入到梨汁中搅匀。（试验添加量0.1/0.2/0.3%）(1ml/l)2.2.4果胶酶处理中ph的选择取0.1%的果胶酶液(l%)?，添加到ph分别为3，4，5的梨汁中用 ph，室温下静置，3h后测透光率。2.2.5果汁成分的调整（补加葡萄糖?补加多少，怎么计算，调至还原糖浓度为170g/l）2.3菌种活化及扩大培养（依据安琪果酒酵母使用说明书活化）2.4前

4、酵工艺2.4.1发酵优良酵母的选择将梨汁分装于1000ml三角瓶中，分别使用两种酵母（耐高温酵母、葡萄酒酒酵母）进行游离果汁发酵实验，发酵条件为糖含量20%总糖，温度自然温度，so2浓度100 mg/l，自然ph，每天测发酵液的糖度、酒度。2.4.2最适so2添加量向发酵梨汁中加入偏重亚硫酸钾，使so2浓度分别达到50 mg/l，100 mg/l，l50 mg/l，200mg/l，发酵条件为糖度20%，温度15-20，接种量10%，自然ph，每天测定酒度变化，并记录发酵推迟天数。2.43最适发酵温度的测定（可省略，暂定2530 ）？发酵温度到底多少将发酵液至于10-15，15-20，20-25

5、条件下发酵，发酵条件为接种量10%，糖度20%，自然ph，so2100 mg/l，每天测定发酵液的酒度，糖度变化情况。2.4.4最适接种量的确定分别按接种量4%，7%，10%，13%将酒母接种到发酵梨汁中，发酵条件为糖度20%，温度15-20，自然ph，so2100mg/l，每天测定酒度，糖度变化情况。2.4.5最适装液量的确定取1000ml的三角瓶，分别按40%，60%，80%的不同装液量进行发酵，发酵条件为糖度20%，自然ph，接种量10%，so2100mg/l，温度15-20，每天测其酒度变化情况。2.4.6最适初始ph值的确定（可省略）用柠檬酸将调糖后的梨汁设为四个ph水平，ph3.0

6、，ph3.5，ph4.0，ph4.5，发酵条件为糖度20%，接种量10%，so2100mg/l，温度15-20，装液量80%，每天测其酒度，主发酵结束后测其最终酒度并进行感官品尝。2.5后酵工艺主发酵结束后，采用虹吸法将上层酒液转移至经干热灭菌的三角瓶中，要注满，不留顶隙，不搅动底部沉淀物，尽量减少酒与空气的接触，防止氧化，然后密闭，静置在(0-10，10一15，15-20)三个温度？不太好控制条件下进行后发酵，时间10-20天，以含残糖？总糖还是还原糖不高于l.5%做为后发酵结束的标准。后发酵结束后测定酒的酒度，透光率，还原糖并进行感官鉴定。2.6陈酿（做果醋用酒可省略）后发酵结束后，将上清

7、液转入经干热灭菌的三角瓶中，密封，置于小于20的环境中存放三个月，经分离过滤得原酒，用于澄清调配.2.7果酒澄清技术研究发酵结束后的新酒是浑浊的，这是因为新酒中含有悬浮状态的酵母、细菌、凝聚的蛋白质、单宁物质、粘液以及梨果组织碎片，为了保证酒的质量，进行澄清实验.（与贵公司沟通，综合考虑投资成本确定）2.8调配实验发酵酒在酒度，糖度，酸度，香气，风味等方面存在不足，为此进行调配实验，使各成分保持适当的比例，酒体协调，滋味醇和，典型性好，通过单因素实验，参考gb/t15037一94国家标准有关感官要求，选用以34)正交设计进行实验。附1：gc-ms法（气质联用仪工作环境）气相色谱条件：色谱柱：h

8、p-5ms，30m*0.25mm*0.25微米；载气为高纯氮气，恒压:35kpa，助燃气：氢气；进样口温度250c，无分流进样；程序升温：35保留2min，以4/min升高至200，再以15/min升高至250，保留10min。质谱条件：hp6890/5973（agilent），载气为高纯氦气。电离方式ei，电离电压70ev，恒压10psi，连接杆温度280。灯丝电流为0.25ma，电子倍增器电压为1500v，扫描范围为:33-350amu。各组分经过计算机nist98和wiley谱库检索及有关资料进行分析鉴定。注：该检测可确定黄玉梨相应澄清梨汁、酿造梨酒、浸泡梨酒中醇、有机酸及芳香酯的组成及

9、百分比。对果酒风味的调配起重要的参考作用。（气质联用仪可联系黄和或应老师课题组借用，可能会缺乏该试验专用毛细管色谱柱，需要我们购买，约2000元）附2：梨醋发酵实验以小型自吸式发酵罐采用半连续分割法工艺进行发酵。试验方案如下。1. 材料与方法1.1菌种：本实验室保藏果醋 专用菌种-以许氏醋酸杆菌（acetobacter-pasteurianus）为主，经多家苹果醋厂驯化（实验室冰箱4密封保存一年）。1.2原料酒：发酵梨酒。1.3种子培养基：葡萄糖 10g；酵母膏15g；磷酸二氢钾5g；硫酸镁 1g定容至800ml。0.1mpa灭菌20min，待冷却至65加无水乙醇27ml。 待冷却至30以下，

10、接种100ml冷藏菌种。1.4种子培养条件：太仓恒温冷冻摇床。取4个500ml锥形瓶，设置温度30；200rpm培养24h。1.5半连续液态发酵液及发酵条件：自来水5l，葡萄糖20g；蔗糖 10g；酵母膏 20g；硫酸铵 3g；烟酰胺0.15g；生物素0.08g。0.1mpa灭菌20min，待冷却至65加梨酒醪2l，底酸2l（9.00g/l）。 待冷却至30左右，接种900ml种子扩培液。（总容积约10l）1.6自吸式发酵罐(15l)发酵实验步骤1.6.1发酵罐空消1.6.2按工艺要求配制发酵醪液1.6.3实消，待冷却至65补酒醪进发酵罐、设置固定的发酵温度（3032）、开始通气1.6.4当发

11、酵液温度达到接种温度时进行接种，测量并记录发酵醪液酒精值、酸度1.6.5调进气阀，保持适宜的进气量（0.25vvm，前期和后期酌情降低）1.6.6测量并记录发酵醪液酒精值、酸度1.6.7酒精值达到规定的排料点，开始出料1.6.8补充适宜数量的酒醪液1.6.9继续并从第5步开始重复。为确保试验顺利展开，现列举需注意点如下：1 分析之前客户所提供的梨中抗氧化能力测定及糖分析数据，假设所有数据均真实可靠（平行组误差较大）。虽然黄玉梨中还原糖含量较高，但葡萄糖含量仍属低水平，而所占比例较大的果糖属酮糖，不易被微生物利用。可能需要调整糖度（浓缩等方法）。2 根据表中数据，初步判定果皮中未知组分项所多出的

12、约2.6%为蜡质，表面蜡质层起到保持果实水分，抗氧化的作用。所以果皮总抗氧化能力最高。但该物质对发酵不利（温水清洗果皮等方法）。3 果核中有效糖含量不高，而且果实种子中含有大量单宁和多酚物质，一旦种子破碎，游离的氨基酸极易与羰基化合物发生羰氨反应，发生非酶促褐变，致使产品色泽风味变差。同时也可解释果核的总抗氧化能力最差。与贵公司研发“高档保健果饮”理念不符。4 营养组成问题，参考国外果醋液态深层发酵生产经验，大多需适量添加营养盐，以保证发酵生产的快速高效。如果选择取消营养盐的使用，相关指标可能会有所下降。5 发酵后熟期时间控制。果酒发酵周期25d，梨醋1d，均指主发酵期。为平衡芳香成分，去除新

13、酒的不良风味，促进悬浮物的充分沉淀，提高产品的澄清效果，需进行较长时间的后熟发酵。该步骤可能会拖延研发周期。6 试验温度控制问题。考虑生产成本问题及实验室现有操作条件限制，是否选择全程标准化控温，以确保样品质量。7 如果试验所得样品作为报检使用，为确保可重复性和真实性，所有仪器均需使用卫生级，严格操作，杜绝污染，考虑到每一个细节。需要做足准备工作。以上是设计试验时想到的几方面问题，试验过程中肯定会出现更多新的问题需要解决。所以建议先做一批试验了解具体情况，再对工艺做针对性改进。果醋饮因其降血压，减肥等功效位居日本保健品消费之首，在国外市场倍受青睐。曾与日本鹿儿岛大学侯德兴教授交流，他在肯定我们

14、实验室研究成果的同时，也非常认同我们的观点，指出做保健醋产品研发，卖点在于其活性物质的分析。需要从有机化学入手，其有效成分无外乎各种各种有机酸，同时作为发酵产品，肯定含有大量氨基酸和多肽。分析出各种物质的浓度后进一步研究，即可确定具体功效。个人觉得就必须走差异化路线，抓住“绿色”、“保健”、“高档”等卖点，附加详尽、科学的分析检测报告，可以更具说服力。所以前期研发投入及生产标准的制定就显得尤为重要。参考资料1：洋梨是我国主要果树之一,分布遍及我国大部分地区。出汁率高达65%80%。营养价值高，每100g洋梨中含有蛋白质0.7g、脂肪0.4g、碳水化合物1314 g、维生素b10.04mg、维生

15、素b20.03mg、维生素c 0.4mg、烟碱酸0.2mg、草酸0.3mg、钙17mg、铁0.3mg、磷22mg、酚类物质0.4g、丹宁0.032mg、总酸0.1%0.5%、柠檬酸0.24%、苹果酸0.12%。参考资料2：氨基酸、脲、铵离子浓度检测：首先将样品通过0.45微米的微孔过滤器，使用氢氧化钠调整ph至7.5，使用合适的稀释系数。脲和铵离子的系数由boehringer-mannheim/r-biopharm (germany)确定。氨基酸浓度使用botella et al；他们的丹酰基衍生物由spectra-physics p200 hplc（高效液相色谱法）使用c18色谱柱(15厘米长，直径0.4厘米)。内装spherisorb ods合成树脂（微粒大小为5微米）。柱温25c，连接至sp 8450uvvis检测器上，测量