胰岛素基因的获取

1、精品文档胰岛素基因的获取和表达实验生物技术一班。1欢迎下载精品文档一、寻找高表达的靶器官, 获取目的mRNA胰脏是胰岛素的高表达器官。胰脏中有胰岛A 细胞和胰岛B 细胞，胰岛A 细胞产生胰高血糖素，胰岛B 细胞产生胰岛素。在胰脏中切除含胰岛B 细胞较多的组织用于提取目的 mRNA1 总 RNA的提取总 RNA的抽提方法有多种，Trizol试剂是使用组广泛的RNA抽提试剂，只要由苯酚和异硫氰酸胍组成，可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质即核内的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整。提取RNA时，首先用液氮研磨材料，匀浆，加入Trizol试剂，进一步破碎细胞并溶解细

2、胞成分。然后加入氯仿抽提，离心，分离水相和有机相，收集含有RNA的水相，通过异丙醇沉淀，可获得比较纯的总RNA，用于下一步mRNA的纯化。2 mRNA的纯化该方法利用mRNA 3端含有PolyA 的特点，当RNA流经寡聚dT 纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性的结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。经过两次寡聚纤维柱后可得到较高纯度的mRNA。3 .RNA甲醛变性胶电泳提取样品的总RNA后，一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量。由于RNA容易形成二级结构，因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳，得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。4. 设计引物根据已知的编码胰岛

3、素的核苷酸序列，设计引物，将目的mRNA筛选出来。5. 合成 cDNA用逆转录法以目的 mRNA为模板，在逆转录酶催化下合成cDNA。目的 mRNA顺序是从NCBI 中搜索得到的，数据如下：Homo sapiens insulin (INS) mRNA, partial cds/translation=WGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCNsig_peptide285/gene=INS/note=insulin A chainORIGIN1ctg

4、gggacctgacccagccgcagcctttgtgaaccaacacctgtgcggctcacacctggt61ggaagctctctacctagtgtgcggggaacg aggcttcttctacacacccaagacccgccg121ggaggcagaggacctgcaggtggggcaggtggagctgggcgggggccctggtgcaggcag181cctgcagcccttggccctggaggggtccctgcagaagcgtggcattgtggaacaatgctg241 taccagcatc tgctccctct accagctgga gaactactgc aacta二

5、、PCR将提取的目的mRNA，在逆转录酶催化下，合成cDNA,然后利用PCR技术获得大量目的基因。三、碱裂解法抽提质粒DNA当目的基因片段10Kbp 时用原核细胞质粒作载体，当目的基因片段23Kbp 用真核细胞质粒作载体。质粒是存在于染色体外的小型双链环状 DNA，能在宿主菌中自主复制，还能编码一些遗传性状，如抗药性，利用这些抗性可以对宿主菌或重组菌进行筛选。碱裂解法制备质粒DNA的原理是：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，细胞内含物从细胞中裂解出来，当加入中和液后质粒DNA分子能够迅速复性呈溶解状态，离心时留在上清中，细胞内含物呈絮状。四、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂

6、作支持介质的一种电泳方法。在一定的电场强度下，DNA分子的电泳迁移率取决于DNA分子本身的大小等，通过电泳条带分析提取的质粒DNA的纯度。五、重组 DNA的制备重组 DNA的核心是用限制性内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接。将获取的大量目的基因与质粒混合，加入限制性内切酶和连接酶，制备重组DNA 分子。六、感受态细胞的制备（CaCl2 转化法）细菌处于零摄氏度CaCl2 低渗溶液中细胞膨胀成球形，细胞壁通透性增强，易于吸收外源 DNA。七、外源 DNA的转化受体细胞接受外源DNA分子后就表现出质粒DNA分子所具有的抗性性状，将经过转化后细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子。筛选的方法及原理： 取一个 LB 固体培养基标记为 1，取两个加有 Amp的 LA 固体培养基分别标记为 2, 、 3，在 1、 2 上分别接种感受态细胞，在 3 上接种转化后的细胞。培养 24 小时后观察现象，若 1 上长出菌落， 2 上未长有菌落，说明感受态细胞有活。3欢迎下载精品文档性，且没有被污染，若3 上也长出菌落，说明转化成功。八提取重组DNA提取重组DNA方法及原理参考三九、感受态细胞的制备因为胰岛素不需要经过糖基化就具有活性，所以编码胰岛素的目的基因可以导入原核细胞中，制备方法及原理参