FCM流式细胞术检测原理及临床应用

1、flow cellinjector tipsheath fluidl鞘液鞘液：辅助样本流能被正常检测的基质液：辅助样本流能被正常检测的基质液l作用：作用： 1.包裹在样本流的周围，使其处于喷嘴中心，以包裹在样本流的周围，使其处于喷嘴中心，以保证检测的精确性；保证检测的精确性； 2.防止样本流中的细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。防止样本流中的细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。injector tipsheath fluidfcm检测信号l散射光信号散射光信号 前向散射光前向散射光（foword scatter, fs）：在激光束正前）：在激光束正前方的检测器，用于检测细胞或其他粒子物体的表面方的检测器，用于检

2、测细胞或其他粒子物体的表面属性，如大小、形状等。反映属性，如大小、形状等。反映细胞颗粒的大小细胞颗粒的大小。 侧向散射光侧向散射光（side scatter， ss）：与激光束垂直方）：与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器，主要用于向的检测器为侧向检测器，主要用于检测细胞内部检测细胞内部结构属性结构属性，可获得细胞内超微结构和颗粒性质的参，可获得细胞内超微结构和颗粒性质的参数。反映颗粒的内部结构复杂程度、表面的光滑程数。反映颗粒的内部结构复杂程度、表面的光滑程度。度。l荧光信号荧光信号 (反映被染上荧光的细胞数量多少）反映被染上荧光的细胞数量多少）fals sensorlaser前向散射光前向

3、散射光 前向散射光前向散射光fals sensor90ls sensorlaser侧向散射光侧向散射光侧向散射光侧向散射光荧光信号l每种荧光染料都有特定的激发波长，受激光激发每种荧光染料都有特定的激发波长，受激光激发后会产生特定波长的荧光和颜色，如绿色、红色后会产生特定波长的荧光和颜色，如绿色、红色、黄色等。流式细胞仪就是利用不同波长的、黄色等。流式细胞仪就是利用不同波长的光学光学滤片滤片来检测这些特定发射波长的光学信号。来检测这些特定发射波长的光学信号。l荧光信号反映被染上荧光的荧光信号反映被染上荧光的细胞数量多少细胞数量多少。常用荧光染料的特性荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm)

4、 用途 颜色fitc 488 525 免疫荧光 绿色pe(rd1) 488 575 免疫荧光 橙色ecd 488 620 免疫荧光 橙红pecy5 488 675 免疫荧光 红pi 488 620 dna染色 橙红pecy7 488 755 免疫荧光 深红percp 488 670apc 633 670laserforward light scatter (size)90o light scatter(granularity)green fluorescencered fluorescencealive or fixed cells in single cells suspensionvibr

5、ating flow cellsheath fluidcollection tubescellsortingprinciple of flow cytometrycomputer for data analysis and result displayfscssc免疫荧光标记l直接免疫荧光染色法直接免疫荧光染色法：选用荧光标记的：选用荧光标记的mcab是直接针对细胞表面抗原特异性标志的单一抗是直接针对细胞表面抗原特异性标志的单一抗体体,如抗如抗cd3-fitc抗体、抗抗体、抗cd4-pe抗体、抗抗体、抗cd8-pecy5抗体。抗体。l间接免疫荧光染色法间接免疫荧光染色法：选用特异性：选用特异性

6、mcab与相与相应抗原结合后，再用荧光素标记的第二抗体进应抗原结合后，再用荧光素标记的第二抗体进行染色。行染色。l双标记或多标记分析：双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪目前使用的流式细胞仪能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信号。检测时需注意号。检测时需注意荧光荧光补偿补偿。常用免疫荧光染料组合荧光染料激发波长（nm）发射波长（nm）颜色fitc+pe488525、575绿色、橙色fitc+pecy5488525、675绿色、红色fitc+ecd488525、625绿色、橙红色fitc+pe+pecy5488525、575、675绿色、橙色、红色

7、fitc+ecd+pecy5488525、625、675 绿色、橙红色、红色4 color single laser (488nm)fitc/pe/ecd/pc5l荧光补偿： 每两种荧光信号间不可避免会出现重叠现象，重叠区越大，信号检测的准确性就越差，因此需计算机工作软件进行自动跟踪调节补偿。根据根据t t淋巴细胞分泌细胞因子的不同还可将淋巴细胞分泌细胞因子的不同还可将cd4+cd4+、cd8+cd8+分为分为 cd4+: th1: cd4+ ifn-r+ th2: cd4+ il4+ th0: cd4+ ifn-r+ il4+ cd8+: tc1: cd8+ ifn-r+ tc2: cd8+

8、 il4+ tc0: cd8+ ifn-r+ il4+辅助性辅助性t t细胞亚群的生物学功能及临床意义细胞亚群的生物学功能及临床意义th1th1细胞：细胞：介导细胞免疫、细胞毒性t细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。th2th2细胞细胞 ：介导体液免疫，促进b细胞的生长、活化和分化，是igg1和ige类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高ige综合症和嗜酸性粒细胞增多症。免疫分型的临床意义 弥补弥补fabfab分型的不足分型的不足 诊断其他血液系统肿瘤诊断其他

9、血液系统肿瘤 诊断仅表达个别非本系列相关抗原的急性诊断仅表达个别非本系列相关抗原的急性 白血病白血病（lyly+ +amlaml、mymy+ +allall） 急性双系或双表型白血病的诊断急性双系或双表型白血病的诊断 骨髓增生异常综合征（骨髓增生异常综合征（mdsmds）免疫表型分析的临床）免疫表型分析的临床意义意义 免疫分型对鉴别慢性淋巴细胞增生性疾病各亚型免疫分型对鉴别慢性淋巴细胞增生性疾病各亚型亦有肯定的诊断价值亦有肯定的诊断价值以下为各系列较特别的标志：以下为各系列较特别的标志： aml： mpo、 cd33、 cdl3、 cdl4 cdl5、 cdllb、 cdllc t-all：

10、cmcd3、 cd2、 cd5、 cd7、 cd4cd8、 cd38 b-all： ccd22、ccd79、 cdl9、 cdl0、 cd24、 hladr、 cd20、 cd38 造血干祖细胞造血干祖细胞: cd34、 cdll7、 cd38、 hla-dr、 acl33在在amlaml各亚型的免疫分型中有时仍较难分辨，有以各亚型的免疫分型中有时仍较难分辨，有以下特点可供参考：下特点可供参考： c d 4 1c d 4 1 、 c d 6 1c d 6 1 是 巨 核 细 胞 的 标 志 ， 见 于是 巨 核 细 胞 的 标 志 ， 见 于 f a bf a b m 7m 7 ， 但， 但

11、血小板粘附于某细胞上可造成假阳性。血小板粘附于某细胞上可造成假阳性。 cd71 cd71与血型糖蛋白是红系的标志，见于与血型糖蛋白是红系的标志，见于fabfabm6m6型。型。 cdl4 cdl4、 cd64cd64是单核细胞的标志，见于是单核细胞的标志，见于m4m4或或m5m5。 fabfabm3m3，t(15t(15；17)17)者典型的免疫表型是者典型的免疫表型是cdl3+cdl3+、 cd33+cd33+、 cd9+cd9+、 cd38+cd38+、 cd34-cd34-、 dr-dr-。 t(8t(8；21)21)m2m2的表型为的表型为 cdl3+cdl3+、 dr+dr+、 cd

12、34+cd34+、 cd33+cd33+、 cdl5+cdl5+、 cdl9+cdl9+或或cd56+cd56+。 m0 m0与与m1m1较难区分，应有髓系标志而无淋系标志，胞浆较难区分，应有髓系标志而无淋系标志，胞浆mpompo应阴应阴性。性。 cd34cd34及及drdr在在m0m0较强，并可伴有较强，并可伴有cd7cd7与与cd4cd4。 cdll7+ cdll7+多见于多见于amlaml。 cd7 cd7常与常与cd34cd34共表达，共表达， cd4cd4见于见于m4m4、m5m5。 cd2+cd2+见于见于m4eom4eo，往往伴有，往往伴有1616号染色体异常。号染色体异常。 m

13、3m3亦可有亦可有 cd56+cd56+表达。表达。正常粒细跑可表达正常粒细跑可表达 cdl0cdl0。由此可见，单抗本身有其多向。由此可见，单抗本身有其多向性，勿轻易判断为杂合型白血病。性，勿轻易判断为杂合型白血病。 t tb ballall可分为几个亚型，然而对临床价值不大。可分为几个亚型，然而对临床价值不大。但若但若b ballall伴有伴有cd34cd34表达时，应进一步作遗传学与基因检表达时，应进一步作遗传学与基因检测，以确定是否是测，以确定是否是ph+allph+all，不论是，不论是m mbcl/ablbcl/abl或或m-bcrm-bcrablmrnaablmrna阳性者，其预

14、后均较差，应接受大剂量化疗或早阳性者，其预后均较差，应接受大剂量化疗或早期接受异基因骨髓移植。期接受异基因骨髓移植。fcmfcm检测白血病微小残留病变检测白血病微小残留病变(mrd)(mrd): : 过去认为过去认为 fcmfcm测定残存白血病细胞不可靠，测定残存白血病细胞不可靠，因为现用的因为现用的 mcabmcab不能鉴别正常血细胞与白血病不能鉴别正常血细胞与白血病细胞。虽然至今细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗原，尚未发现白血病细胞特异抗原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特征，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特征， fcmfcm检测的敏感度可明显提高检测的敏感度可明显提高白血病

15、细胞的某些抗原表达量明显高于相应白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应的正常血细胞的正常血细胞 如小儿如小儿allall，其，其cdl0cdl0+ +细胞的荧光强度可高细胞的荧光强度可高达达3-43-4个对数值，而其个对数值，而其 cd45cd45则为弱阳性或阴则为弱阳性或阴性。性。相应正常细胞相应正常细胞 cdl0cdl0+ +的细胞荧光强度约为的细胞荧光强度约为2 2个个对数值，对数值， cd45cd45为阳性。若能定量则更可靠。为阳性。若能定量则更可靠。组织标本的正确处理：组织标本的正确处理： 去除脂肪、结缔组织去除脂肪、结缔组织 洗涤除去红细胞洗涤除去红细胞 用眼科剪剪成肉糜状用眼科剪

16、剪成肉糜状 用用250250至至350350目的铜网过滤目的铜网过滤要求：要求： 细胞碎片、细胞连片少，单细胞要多细胞碎片、细胞连片少，单细胞要多细胞周期：细胞周期：dna 倍体倍体g0 期：期：dna 合成静止期合成静止期2ng1 期：期：dna 合成前期合成前期2ns 期：期： dna 合成期合成期2n-4ng2 期：期：dna 合成后期合成后期4nm 期：期： 细胞分裂期细胞分裂期4ndna非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指标: 良性肿瘤和正常组织良性增生不出现良性肿瘤和正常组织良性增生不出现dnadna非非2 2倍体细胞倍体细胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；而恶性肿瘤常可出现异

17、倍体细胞；实体瘤以多倍体居多；实体瘤以多倍体居多；实体恶性肿瘤的非实体恶性肿瘤的非2 2倍体出现率倍体出现率70%,70%,淋巴瘤和白血病淋巴瘤和白血病以亚二倍体居多以亚二倍体居多, ,出现率达出现率达50%50%。交界性肿瘤形态学介于良恶性之间交界性肿瘤形态学介于良恶性之间, ,难于监别。如果交难于监别。如果交界性肿瘤出现异倍体即已具有恶性特征界性肿瘤出现异倍体即已具有恶性特征,尽管病理形尽管病理形态学尚不能证实态学尚不能证实, ,也应视为恶性。也应视为恶性。观察病情演变观察病情演变判断预后判断预后 非整倍体的肿瘤恶性程度高，复发率高，预后差。非整倍体的肿瘤恶性程度高，复发率高，预后差。近二倍体和二倍体肿瘤近二倍体和二倍体肿瘤 : : 预后好。预后好。 但少数肿瘤的但少数肿瘤的dnadna分析对预后无判