液相色谱NXPowerLite

1、色谱分析之：色谱分析之：液相色谱液相色谱沈晓芳沈晓芳高效液相色谱法：高效液相色谱法：以液体作为流动相的色谱法。它是在经典以液体作为流动相的色谱法。它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速分离分析技术。具有分离效能高，检出限低，操作自动快速分离分析技术。具有分离效能高，检出限低，操作自动化和应用范围广的特点。化和应用范围广的特点。一、概述一、概述 generalization液相色谱仪液相色谱仪经典液相色谱经典液相色

2、谱高效液相色谱高效液相色谱常压或减压常压或减压填料颗粒大填料颗粒大柱效低柱效低分析速度慢分析速度慢色谱柱只用一次色谱柱只用一次 不能在线检测不能在线检测高压，高压，404050mpa50mpa填料颗粒小，填料颗粒小，2 250m 50m 柱效高柱效高,40000,400006000060000块块/m /m 分析速度快分析速度快 色谱柱可重复多次使用色谱柱可重复多次使用 能在线检测能在线检测气相色谱气相色谱高效液相色谱高效液相色谱只能分析挥发性物质，只能分只能分析挥发性物质，只能分析析20%20%的化合物的化合物不能用于热不稳定物质的分析不能用于热不稳定物质的分析用毛细管色谱可得到很高的柱用毛

3、细管色谱可得到很高的柱效效有很灵敏的检测器如有很灵敏的检测器如ecdecd和较灵和较灵敏的通用检测器（敏的通用检测器（fidfid和和tcdtcd）流动相为气体，无毒，易于处流动相为气体，无毒，易于处理理 运行和操作容易运行和操作容易 仪器制造难度较小仪器制造难度较小几乎可以分析各种物质几乎可以分析各种物质 可以用于热不稳定物质的分析可以用于热不稳定物质的分析色谱柱不能很长，柱效不会很色谱柱不能很长，柱效不会很高高没有较高灵敏的通用检测器没有较高灵敏的通用检测器 流动相有毒，费用较高流动相有毒，费用较高 运行和操作比运行和操作比gcgc难一些难一些 仪器制造难度大仪器制造难度大 近来出现的蒸发

4、激光光散射检测器（近来出现的蒸发激光光散射检测器（elsd）是灵敏度较高的通用检测器）是灵敏度较高的通用检测器流动相差别流动相差别 gc：流动相为惰性气体：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。 hplc：流动相为液体：流动相为液体 组分与流动相和固定间有亲合作用力，为提高柱的选择性、组分与流动相和固定间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用。改善分离度增加了因素，对分离起很大作用。 流动相种类较多，选择余地广流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和流动相极性和ph值的选择也对分离起到重要作用值的

5、选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性可以增大分离选择性操作条件差别操作条件差别 gc：加温操作：加温操作 hplc：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）流程及主要部件流程及主要部件三、三、高效液相色谱法的特点和应用高效液相色谱法的特点和应用特点：特点：高柱效高柱效n=104片片/米，柱效高（远高于一般米，柱效高（远高于一般lc）高灵敏度高灵敏度(紫外：紫外：10-9g；荧光：；荧光：10-11g)高选择性高选择性分析速度快分析速度快(1h)应用范围广泛（可分析应用范围

6、广泛（可分析80%有机化合物有机化合物（是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。）（是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。）1 按固定相的聚集状态可分为：按固定相的聚集状态可分为： 液液色谱法(llc) 液固色谱法(lsc) 2 按分离机制可分为：按分离机制可分为： 分配色谱法 吸附色谱法 化学键合相色谱法 离子交换色谱法 分子排阻色谱法 亲和色谱法高效液相色谱的分类高效液相色谱的分类四、流程及主要部件四、流程及主要部件process and main assembly of hplc1.1.流程流程液相色谱流程图液相色谱流程图pumpdetectorwdata st

7、ation (recorder) or collection2.主要部件主要部件(1) 高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)4. 选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1

8、）尽量使用）尽量使用高纯度高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并，防止产生沉淀并在柱中沉积。在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测。当使用紫外检测器时，流动相不应有

9、紫外吸收。器时，流动相不应有紫外吸收。选择高效液相中溶剂的示意图选择高效液相中溶剂的示意图 一、影响分离的因素一、影响分离的因素 factors influenced separation1. 影响分离的因素与提高柱效的途径影响分离的因素与提高柱效的途径 在高效液相色谱中在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项之一，则速率方程中的分子扩散项b/u较小，可以忽略不较小，可以忽略不计，计， 根据根据van deemter方程，板高方程，板高h ： u 为流动相线速度；为流动相线速度； a分别表示涡流扩散系数；分别表示涡流扩散系数；

10、b分子扩散系数；分子扩散系数； c传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。h = a + c u 故液相色谱故液相色谱h-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。cuubah 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。降低传质阻力是提高柱效主要途径。 由速率方程，由速率方程， 降低固定相粒度可提高柱效降低固定相粒度可提高柱效。 液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。 改变淋洗液组成、

11、极性是改善分离的最直接的因素。改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。2epa hd 2.流速流速 流速大于流速大于0.5 cm/s时时, hu曲线是一段斜率不大的直线。降曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，在实际操作中，流量是一个调整流量是一个调整分离度和出峰时间的重要参数。分离度和出峰时间的重要参数。 3.固定相及分离柱固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项则与气相色谱一样。但在高效液相

12、色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。速率方程可简化为：速率方程可简化为： hdd udd udppmfs222 dm、ds试样分子在流动相、固定液中的扩散系数试样分子在流动相、固定液中的扩散系数 关键是将关键是将h变小，而变小，而h变小关键是使为变小关键是使为填料粒径填料粒径 dp变变小，小，固定液液膜厚度固定液液膜厚度 df变小。因此采用变小。因此采用35 m 固定相颗固定相颗粒，且键合相层薄，因此粒，且键合相层薄，因此df就小，由于就小，由于h很小，很小，n很多，很多，r大改进，实现了高效。大改进，实现了高效。 在分离良

13、好的基础上，才可提高流动相线速，节省了在分离良好的基础上，才可提高流动相线速，节省了分析时间，从而实现了高速分离。分析时间，从而实现了高速分离。如何实现高速分离？如何实现高速分离？影响色谱峰扩展的因素影响色谱峰扩展的因素二、分离类型选择二、分离类型选择 choice of separation types 5液相色谱检测器液相色谱检测器分类标准分类标准种类种类响应原理响应原理特点特点常用类型常用类型按检测按检测器性质器性质或应用或应用范围分范围分类类总体性能总体性能检测器检测器响应值取决于流出物（包括响应值取决于流出物（包括样品和流动相）某些物理性样品和流动相）某些物理性质的总的变化的检测器质

14、的总的变化的检测器有广泛的适用范围有广泛的适用范围，基线噪音和漂移，基线噪音和漂移较大，灵敏度低，较大，灵敏度低，不适于痕量分析，不适于痕量分析，不能用于梯度洗脱不能用于梯度洗脱示差折光率检测示差折光率检测器器介电常数检测器介电常数检测器电导检测器电导检测器溶质性能溶质性能检测器检测器响应值取决于流动相中溶质响应值取决于流动相中溶质的物理或化学特性的检测器的物理或化学特性的检测器检测灵敏度高，受检测灵敏度高，受操作条件和外界环操作条件和外界环境影响小，可用于境影响小，可用于梯度洗脱，应用范梯度洗脱，应用范围受限制围受限制紫外紫外-可见检测器可见检测器荧光检测器荧光检测器化学发光检测器化学发光检

15、测器安培检测器安培检测器手性检测器手性检测器 按测量按测量信号性信号性质分质分浓度敏感浓度敏感性检测器性检测器响应值正比于溶质在流动相响应值正比于溶质在流动相中的浓度，测量的是流动相中的浓度，测量的是流动相中溶质浓度瞬间的变化中溶质浓度瞬间的变化样品量一定时，检样品量一定时，检测器瞬间响应即峰测器瞬间响应即峰高响应值和流动相高响应值和流动相流速无关，峰面积流速无关，峰面积与流速成反比，峰与流速成反比，峰面积与流速乘积为面积与流速乘积为常数常数大部分常用的液大部分常用的液相色谱检测器都相色谱检测器都属于该类检测器属于该类检测器检测器的分类检测器的分类 ：按按测测量量原原理理分分光学性质光学性质检

16、测器检测器根据被测物质对光的吸收、根据被测物质对光的吸收、发射和散射等性质进行检测发射和散射等性质进行检测的的应用范围广，灵敏应用范围广，灵敏度高度高紫外紫外-可见检测器可见检测器，示差折光率检，示差折光率检测器，蒸发光散测器，蒸发光散射检测器，荧光射检测器，荧光检测器，化学发检测器，化学发光检测器，手性光检测器，手性检测器检测器 电学及电电学及电化学性质化学性质检测器检测器根据被测物电化学性质进行根据被测物电化学性质进行检测检测 安培检测器，电安培检测器，电导检测器，库仑导检测器，库仑检测器，介电常检测器，介电常数检测器，极谱数检测器，极谱检测器检测器热学性质热学性质检测器检测器利用热学原理

17、进行检测利用热学原理进行检测 光声检测器，热光声检测器，热透镜和光热偏转透镜和光热偏转检测器检测器按信号按信号记录方记录方式分式分积分型检积分型检测器测器显示的信号是指在给定时间显示的信号是指在给定时间内物质通过检测器的总量内物质通过检测器的总量灵敏度低，定性困灵敏度低，定性困难，应用少难，应用少 微分型检微分型检测器测器显示的信号表示在给定时间显示的信号表示在给定时间内每一瞬间时通过检测器的内每一瞬间时通过检测器的量量灵敏度高灵敏度高 紫外检测器特点：紫外检测器特点： 应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。 灵敏度高；灵敏度高； 线形范围高；线形范围高； 流

18、通池可做的很小（流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积，容积 8l）；）； 对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作；波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。 b. b. 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器示差折光效应示差折光检测器 differential refractive index de

19、tectorc. 示差折光检测器示差折光检测器（differential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器；除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；值。差值与浓度呈正比； 优点优点：通用型检测器通用型检测器（每种物质具有不同（每种物质具有不同的折光指数）；的折光指数）； 缺点：缺点：灵敏度低、对灵敏度低、对温度敏感、不能用于温度敏感、不能用于梯度洗脱；梯度洗脱； 分类：分类：偏转式、反射偏转式、反射式和干涉型三种；式和干涉型三种

20、；示差折光检测器示差折光检测器荧光检测器荧光，又作荧光，又作“萤光萤光”，是指一种光致发光的冷发光现，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或外线或x射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；常波长在可见光波段）；荧光荧光：从激发态分子衰变为自旋多重度相同的基态或低激发态时的自发发射现象。 荧光检测器荧光检测器荧光检测器特点：荧光检测器特点：（fluorescenc

21、e detector）高灵敏度；高灵敏度；高选择性；高选择性；对多环芳烃，维生素对多环芳烃，维生素b、黄曲霉素、卟啉类、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；等有响应；缺点：应用范围有限缺点：应用范围有限电化学检测器安培检测器：随着化合物被氧化或还原，产生正比于浓度的电流电导检测器 conductivity detector 制备型液相色谱制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。 制备柱：内径制备柱：内径2050mm，柱

22、长，柱长50cm。半制备柱（内径。半制备柱（内径8mm，长度，长度15 30cm），一次制备量），一次制备量.1mg；四、制备型液相色谱四、制备型液相色谱preparativeliquidchromatography1.色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子超载可提高制备效率，以柱效下降一

23、半或容量因子k降降低低10%为宜。为宜。2. 液相制备色谱的方法液相制备色谱的方法收集组分时：收集组分时： （1）主峰使用制备柱，超载）主峰使用制备柱，超载提高效率；提高效率； （2）两主成分之间的小组分；）两主成分之间的小组分； 超载，分离切分使待分离组分成超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离为主成分（富集）后，再次分离制备。制备。 一、超临界流体色谱的特点与原理一、超临界流体色谱的特点与原理feature and principle of sfc二、超临界流体色谱仪的结构流程二、超临界流体色谱仪的结构流程structure and general process of

24、sfc 三、超临界流体色谱的应用三、超临界流体色谱的应用application of sfc五五 超临界色谱超临界色谱supercritical fluid chromatograph, sfc一、超临界流体色谱的特点与原理一、超临界流体色谱的特点与原理principle and character of supercritical fluid chromatography1.概述概述 超临界流体：温度及压力均处于临界点以上的液体叫超临超临界流体：温度及压力均处于临界点以上的液体叫超临界流体界流体(supercritical fluid)。性质介于液体和气体之间。性质介于液体和气体之间。 超临

25、界流体色谱超临界流体色谱(scf)具有液相、气相色谱不具有的优点具有液相、气相色谱不具有的优点:（1）可处理高沸点、不挥发试样；）可处理高沸点、不挥发试样；（2）比）比lc有更高的柱效和分离效率。有更高的柱效和分离效率。2. 超临界流体性质超临界流体性质（1）性质介于液体和气体之间）性质介于液体和气体之间; 具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之间。具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之间。（2）可通过改变超临界流体的密度（程序改变）调节组分分离）可通过改变超临界流体的密度（程序改变）调节组分分离（类似于气相色谱的程序升温，液相色谱中的梯度淋洗）。（类似于气相色谱的程序

26、升温，液相色谱中的梯度淋洗）。 (3) 超临界流体的密度与压力有关。超临界流体的密度与压力有关。3.超临界色谱原理超临界色谱原理 sfc的流动相：的流动相：超临界流体；超临界流体；co2、n2o、nh3 sfc的固定相：的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱sfc和毛细管柱和毛细管柱sfc； 分离机理：分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离；被分离； 通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调

27、整组分通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值；保留值；压力效应压力效应： sfc的柱压降大（比毛细管色谱大的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），对分离有影响（倍），对分离有影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）；柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）；超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点，影响小超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点，影响小;压力效应：压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力效应：压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。压力增加而增加，密度增加提高溶剂

28、效率，淋洗时间缩短。 co2流动相，当压力改变：流动相，当压力改变：7.09.0106 pa，则：，则： c16h34的保留时间的保留时间 25min 5min。程序升压hplc与sfc比较二、二、超临界流体色谱的结构与流程超临界流体色谱的结构与流程instrument structure and the general process of sfc1.1.结构流程结构流程 2.主要部件（1）sfc的高压泵的高压泵 无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量；计算机控制流动相的密度和流量； （2）sfc的色谱柱和

29、固定相的色谱柱和固定相 可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱；可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱； sfc的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱sfc；主要部件（3）流动相）流动相 sfc的流动相：超临界流体；的流动相：超临界流体；co2、n2o、nh3 co2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；等改性；（

30、4）检测器）检测器 可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的fid检测器检测器液相色谱实用技术色谱柱的使用及保养色谱柱的保养（一） 样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度 如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用色谱柱的保养（二） 流动相方面 除去微粒 纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 缓冲液的ph值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量 流动相对样品的溶解度 有机溶剂或水的比例在线的保护装置 给色谱柱提

31、供物理的保护 除去样品及流动相中的颗粒 给色谱柱提供化学的保护 防止分析柱被化学污染 装置 在线过滤器 自装填料保护柱 预装保护柱在线过滤器 in-line filter防止颗粒在色谱柱头累积优点：基本不影响柱效在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分析）保护柱 可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时 保护柱的种类 普通自装填料的保护柱 用户自装填料 影响柱效同装填技术有关，柱效降低较大 预装保护柱 有各种填料的预装柱供选择，使用方便。 填料容积较小，也引起柱效降低色谱柱的清洗 对所做的样品要有充分的了解 用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗 硅胶柱的一般方法 先用甲

32、醇洗去极性杂质 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化 键合相柱(烷基)的一般方法 20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗记住每种色谱柱可能有特定的方法记住每种色谱柱可能有特定的方法 一定要先看其使用说明！ 一定要先看其使用说明！色谱柱的存放 存放前的处理 除去杂质、盐 合适的存放溶剂 避免色谱柱床的干枯 避免机械震动 防止细菌生长 注意存放的温度色谱柱常见毛病 柱压过高 多少才算高? 不同色谱柱有差异 不同系统有差异 不同溶剂有差异 柱效低 重复性差 不出峰，回收率低柱压过高 为什么柱压会过高 微粒堵塞 样品 流动相 密封垫 柱床膨胀 不可逆吸附 细菌生长柱效低 为什么柱效低

33、 色谱柱被污染 过滤片部分堵塞 样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞 色谱柱内的死体积 流动相ph值及组成不合适造成固定相流失 流速急剧变化造成固定相物理损坏 机械震动造成固定相产生裂缝 柱床收缩或干枯重复性差、回收率低 实验的重复性差 色谱柱被污染 流动相ph值及组成不合适造成键合相流失 样品溶剂不同或样品本身不稳定 回收率低，不出峰 “不可逆”吸附 固定相过强或流动相过弱 非特异性吸附色谱柱以外的因素（一） “柱效”问题，不一定是色谱柱问题！ 仪器问题：连接不好造成死体积 进样器 检测器 管路，连接口 保护柱 在线过滤器堵塞 流动相问题：色谱柱未平衡好 进样量太大色谱柱以外的因素（二）

34、 柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！ 系统反压问题 阻尼器堵塞 进样器堵塞 管路或连接口堵塞 在线过滤器不干净 保护柱 压力传感器不准确 流速是否错误?色谱柱以外的因素（三） 实验的重复性差 梯度实验时平衡时间不足 温度波动 流动相组成改变 样品溶剂不同 样品稳定性不好 方法的开发不好 缓冲液的ph值不合适 缓冲液的缓冲能力不足简单的判别方法 高的柱反压是否伴随着 保留时间变化? 峰形变坏? 分辨率变坏? 测量色谱系统的谱带展宽 典型的分析系统应远小于 100 微升 如大于此数应检查仪器系统流动相及样品的预处理液相色谱实用技术（二）液相色谱对流动相的要求 除色谱柱对流动相的要求外，还有 与检测器匹配 脱气 避免卤素离子（不锈钢系统） 溶剂的粘度 细菌的生长流动相的脱气 流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并