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文档简介
1、高效液相色谱法高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography第一节、概述第一节、概述 一、含义一、含义 液相色谱液相色谱 (LC) :以溶剂液体为流动以溶剂液体为流动相的色谱方法相的色谱方法 高效液相色谱(高效液相色谱(HPLC):): 高效能固体细微粒为固定相高效能固体细微粒为固定相 高压溶剂为流动相高压溶剂为流动相 高灵敏度检测器高灵敏度检测器二、高效液相色谱与其它色谱方法的比较二、高效液相色谱与其它色谱方法的比较1. HPLC与经典与经典LC的比较的比较经典经典LCHPLC固定相颗粒固定相颗粒100m, ,不均匀不均匀 固定相颗粒固定相颗粒B
2、C正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系HPLC方法方法按流动相和固定相特征分为按流动相和固定相特征分为 正相色谱、反相色谱正相色谱、反相色谱按分离目的分为按分离目的分为 分析型、制备型分析型、制备型按分离机理分为按分离机理分为 吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱等。空间排阻色谱等。第三节第三节 HPLC方法及原理方法及原理 一、液一、液-液分配色谱法(液分配色谱法(LLPC)二、化学键合相色谱法(二、化学键合相色谱法(CBPC)三、液三、液-固吸附色谱法固吸附色谱法(LSAC)四、离子交换色谱法(四、离子交换色谱法(
3、IEC)五、离子对色谱法(五、离子对色谱法(IPC)六、六、尺寸排阻色谱法(尺寸排阻色谱法(SEC)七、亲和色谱法(七、亲和色谱法(AC) 一、液一、液-液分配色谱法(液分配色谱法(LLPC) 1.固定相固定相强极性强极性固定液:固定液:,一氧二丙睛一氧二丙睛中等极性中等极性固定液:聚乙二醇固定液:聚乙二醇非极性非极性固定液:角鲨烷固定液:角鲨烷 要求:要求:流动相不与固定相互溶,流动相不与固定相互溶,流动相与固定相极流动相与固定相极性差别显著性差别显著避免固定液流失避免固定液流失 2.流动相流动相 一、液一、液-液分配色谱法(液分配色谱法(LLPC)适于各种极性化合物的分离适于各种极性化合物
4、的分离 4. 用途用途 根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同,具有不同的分配系数。同,具有不同的分配系数。 3.分离原理分离原理缺点:固定液机械涂渍、缺点:固定液机械涂渍、固定液易流失固定液易流失1、反相键合相色谱法(、反相键合相色谱法(RPBPC)p 固定相:固定相: 采用极性较小的键合固定相,如硅胶采用极性较小的键合固定相,如硅胶-C18H37(ODS,C18)、硅胶)、硅胶-苯基等苯基等二、化学键合相色谱法(二、化学键合相色谱法(CBPC)p流动相:流动相: 采用极性较强的溶剂,如甲醇、乙睛采用极性较强的溶剂,如甲醇、乙睛-水、水和水、水和无
5、机盐的缓冲溶液等。无机盐的缓冲溶液等。 分离机理分离机理疏溶剂作用理论疏溶剂作用理论非极性的烷基键合相非极性的烷基键合相硅胶表面的硅胶表面的十八烷十八烷基基“分子毛分子毛”较强的疏水特性。较强的疏水特性。二、化学键合相色谱法(二、化学键合相色谱法(CBPC)1、反相键合相色谱法(、反相键合相色谱法(RPBPC)分子中非极性部分分子中非极性部分疏水烷基疏水烷基 缔合作用,分子保留缔合作用,分子保留分子极性部分分子极性部分极性流动相极性流动相 离开固定相,减小保留离开固定相,减小保留两种作用力之差,决定分子在色谱中的保留行为两种作用力之差,决定分子在色谱中的保留行为流动相流动相极性溶剂极性溶剂分离
6、物分离物极性官能团有机极性官能团有机物物改变流动相配比可分离极性化合物改变流动相配比可分离极性化合物用水和无机盐的缓冲液为流动相可分离易离解的用水和无机盐的缓冲液为流动相可分离易离解的样品有机酸、有机碱等。样品有机酸、有机碱等。 用途用途 1、反相键合相色谱法(、反相键合相色谱法(RPBPC) 主要用于分离非极性至中等极性的各类有机化合物主要用于分离非极性至中等极性的各类有机化合物二、化学键合相色谱法(二、化学键合相色谱法(CBPC)p固定相:固定相:极性的有机基团,极性的有机基团,CN、NH2。双羟基等双羟基等键合在硅胶表面键合在硅胶表面p流动相:流动相:非极性或极性小的溶剂(如正已烷)中非
7、极性或极性小的溶剂(如正已烷)中加入适量极性溶剂(如氯仿、醇等)加入适量极性溶剂(如氯仿、醇等) p分离机理:分离机理:范德华力、诱导力或氢键力范德华力、诱导力或氢键力p用途:用途:多用于分离极性或中等极性化合物多用于分离极性或中等极性化合物2、正相键合相色谱法(、正相键合相色谱法(NPBPC)二、化学键合相色谱法(二、化学键合相色谱法(CBPC)3、离子键合相色谱法离子键合相色谱法 固定相:固定相:硅胶为基质,键合各种离子交换基团,如硅胶为基质,键合各种离子交换基团,如一一SO3H、一、一CH2NH2、C00H流动相:流动相:一般采用缓冲溶液。一般采用缓冲溶液。二、化学键合相色谱法(二、化学
8、键合相色谱法(CBPC)分离原理:分离原理:与离子交换色谱类同与离子交换色谱类同用途:用途:多用于分离离子形化合物如酸、无机阴阳离多用于分离离子形化合物如酸、无机阴阳离子、氨基酸等子、氨基酸等分离原理分离原理:物质在固定相上的吸附作用不同物质在固定相上的吸附作用不同三、液三、液-固吸附色谱法固吸附色谱法(LSAC)固定相固定相:吸附活性强弱不等的吸附剂吸附活性强弱不等的吸附剂 硅胶、氧化铝、聚酸胶等硅胶、氧化铝、聚酸胶等。流动相:流动相:各种极性的洗脱剂各种极性的洗脱剂用途:用途:非极性溶剂中、具有中等相对分子质量且为非非极性溶剂中、具有中等相对分子质量且为非离子型的试样。离子型的试样。 特别
9、适用于分离异构体特别适用于分离异构体原理:原理:不同不同待测离子待测离子对固定相对固定相亲和力的差别亲和力的差别固定相:固定相:基质:合成树脂(聚苯乙烯)、纤维素和硅胶基质:合成树脂(聚苯乙烯)、纤维素和硅胶表面键合离子:阳离子和阴离子交换树脂表面键合离子:阳离子和阴离子交换树脂四、离子交换色谱法(四、离子交换色谱法(IEC)流动相:流动相:一定一定pH和盐浓度的缓冲溶液和盐浓度的缓冲溶液用途:用途:适用无机离子、有机离子混合物的分离例如适用无机离子、有机离子混合物的分离例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。 有机相有机相水相水相水相水相BABA 离子对离子对
10、AB具有疏水性,被非极性固定相提取具有疏水性,被非极性固定相提取 不同待测离子不同待测离子A1,A2与与B离子间成对能力不同,形离子间成对能力不同,形成不同疏水性离子对,从而保留值不同成不同疏水性离子对,从而保留值不同原理:原理:将与待测物离子将与待测物离子A电荷相反的离子电荷相反的离子B加入到流加入到流动相中形成离子对动相中形成离子对AB,间接改变待测离子保留特性,间接改变待测离子保留特性五、离子对色谱法(五、离子对色谱法(IPC)如:固定相为非极性键合相,流动相为水溶液如:固定相为非极性键合相,流动相为水溶液用途:用途:主要用来分离强极性有机酸和有机碱主要用来分离强极性有机酸和有机碱固定相
11、:固定相: 化学惰性的多孔性材料,如聚苯乙烯凝胶、化学惰性的多孔性材料,如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。亲水凝胶、无机多孔材料。 流动相:流动相: 作用不是为了控制分离,而是为了溶解样作用不是为了控制分离,而是为了溶解样品或减小流动相粘度。品或减小流动相粘度。 六、尺寸排阻色谱法(六、尺寸排阻色谱法(SEC)常用流动相常用流动相四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水原理:原理:利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离。性渗透实现分离。凝胶过滤色谱:凝胶过滤色谱: 以水或缓冲液作流动相以水或缓冲液作流
12、动相主要适合于水溶性高分子的分离主要适合于水溶性高分子的分离凝胶渗透色谱:凝胶渗透色谱: 以有机溶剂作流动相以有机溶剂作流动相主要适合于脂溶性高分子的分离主要适合于脂溶性高分子的分离用途用途六、尺寸排阻色谱法(六、尺寸排阻色谱法(SEC)特点:特点:固定相与分子间作用力趋于零,柱寿命长固定相与分子间作用力趋于零,柱寿命长相对分子质量差别必须大于相对分子质量差别必须大于10才能分离才能分离七、亲和色谱法(七、亲和色谱法(AC) 原理:原理:利用生物大分子和固定相表面存在生利用生物大分子和固定相表面存在生化特异性亲和力,进行选择性分离化特异性亲和力,进行选择性分离固定相:固定相:生物专一性配基生物
13、专一性配基+载体载体流动相:流动相:一定一定pH的缓冲液的缓冲液具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留;没有亲和力作用的分子不被保留。留;没有亲和力作用的分子不被保留。用途:用途: 蛋白、酶、抗体分离,生物和医药分析蛋白、酶、抗体分离,生物和医药分析第四节第四节 HPLC分离条件的选择分离条件的选择kk114nR ;CuuBAH 根据根据van Deemter方程和色谱分离方程式选择分析条件方程和色谱分离方程式选择分析条件 在高效液相色谱中在高效液相色谱中, 速率方程中的分子扩散项速率方程中的分子扩散项B/U较小,可以忽略不计,而只有两项,即
14、:较小,可以忽略不计,而只有两项,即: H = A + C u(1)固定相:)固定相:粒度小,均匀,以减小涡流扩散和流动粒度小,均匀,以减小涡流扩散和流动相传质阻力;相传质阻力;改进结构,采用大孔径和浅孔道的表面改进结构,采用大孔径和浅孔道的表面多孔型载体或全多孔微粒型载体,减少多孔型载体或全多孔微粒型载体,减少滞留流动相传质阻力。滞留流动相传质阻力。第四节第四节 HPLC分离条件的选择分离条件的选择kknRCuAH114 ;(2)流动相:)流动相:低粘度的流动相低粘度的流动相增大组分增大组分 在溶剂中的扩散在溶剂中的扩散系数系数Dm减少传质阻力减少传质阻力(3)流速:)流速:最佳流速在流速很
15、小处,减小流速有利提高柱效最佳流速在流速很小处,减小流速有利提高柱效常采用比最佳流速高数倍的流速常采用比最佳流速高数倍的流速加快分析速度加快分析速度第四节第四节 HPLC分离条件的选择分离条件的选择kknRCuAH114 ;(4)柱温:)柱温:提高柱温提高柱温降低流动相粘度降低流动相粘度减少减少传质阻力传质阻力分辨率降低,柱寿命短,分辨率降低,柱寿命短,易产生气泡,易产生气泡,一般在室温下进行一般在室温下进行第四节第四节 HPLC分离条件的选择分离条件的选择kknRCuAH114 ;第五节第五节 HPLC的建立与应用的建立与应用一、建立一、建立HPLC分析方法的一般步骤分析方法的一般步骤 1、
16、根据被分析样品的特性选择适用于、根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种样品分析的一种HPLC分离方式。分离方式。p材料来源、浓度范围材料来源、浓度范围p组分特性、结构、分子量、溶解性等组分特性、结构、分子量、溶解性等一、建立一、建立HPLC分析方法的一般步骤分析方法的一般步骤 一、建立一、建立HPLC分析方法的一般步骤分析方法的一般步骤 2、选择、选择合适的分析方法合适的分析方法p适用的色谱柱:适用的色谱柱:柱的规格(柱内径及柱的规格(柱内径及柱长)和选用固定相(粒径及孔径)柱长)和选用固定相(粒径及孔径)p流动相流动相p检测器检测器p样品预处理样品预处理一、建立一、建立HPLC分析方法
17、的一般步骤分析方法的一般步骤 3.分析条件的优化分析条件的优化p流动相种类与配比流动相种类与配比p梯度梯度p温度温度p流速流速p检测波长检测波长p进样量进样量一、建立一、建立HPLC分析方法的一般步骤分析方法的一般步骤 4、由获得的色谱图进行定性分析和定、由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。量分析。二、二、HPLC定性定量分析方法定性定量分析方法1 1、定性分析、定性分析色谱鉴定法:色谱鉴定法:保留时间对照保留时间对照化学鉴定法:化学鉴定法:利用专属化学反应对分离利用专属化学反应对分离 后收集的组分定性后收集的组分定性色谱色谱-光谱联用定性光谱联用定性 非在线色谱光谱联用法:非在线色谱光谱联
18、用法: 色谱光谱联用仪色谱光谱联用仪二、二、HPLC定性定量分析方法定性定量分析方法2 2、定量分析、定量分析外标法:外标法:外标工作曲线法、外标一点法、外标工作曲线法、外标一点法、外标二点法等外标二点法等 不需知道校正因子,但需进样量准确不需知道校正因子,但需进样量准确内标法:内标法:内标工作曲线法、内标一点法、内标工作曲线法、内标一点法、内标二点法、内标对比法内标二点法、内标对比法1、在食品分析中的应用、在食品分析中的应用p食品营养成分分析:食品营养成分分析:蛋白质、氨基酸、糖类、蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、矿物质等;色素、维生素、香料、矿物质等;p食品添加剂分析:食品添加剂
19、分析:甜味剂、防腐剂、着色剂、甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧化剂等;抗氧化剂等;p食品污染物分析:食品污染物分析:霉菌毒素、微量元素、多霉菌毒素、微量元素、多环芳烃等。环芳烃等。 2、在环境分析中的应用、在环境分析中的应用 多环芳烃、农药(如氨基甲酸脂类)残留等。多环芳烃、农药(如氨基甲酸脂类)残留等。三、三、HPLC的应用的应用3、在生命科学中的应用、在生命科学中的应用 分子水平上研究生命科学、遗传工程、临分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等必不可少的工具床化学、分子生物学等必不可少的工具p低分子量物质:氨基酸、有机酸、有机胺、低分子量物质:氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、
20、卟啉、糖类、维生素等分离和测定类固醇、卟啉、糖类、维生素等分离和测定p高分子量物质:多肽、核糖核酸、蛋白质和高分子量物质:多肽、核糖核酸、蛋白质和酶的纯化、分离和测定酶的纯化、分离和测定三、三、HPLC的应用的应用4、在医学检验中的应用、在医学检验中的应用 体液中代谢物测定;药代动力学研究;临体液中代谢物测定;药代动力学研究;临床药物监测:床药物监测:p合成药物:抗生素、抗忧郁药、黄胺类药等合成药物:抗生素、抗忧郁药、黄胺类药等p天然药物:生物碱(吲哚碱、强心甙)等天然药物:生物碱(吲哚碱、强心甙)等5、在无机分析中的应用、在无机分析中的应用 阳、阴离子的分析等。阳、阴离子的分析等。三、三、H
21、PLC的应用的应用我国药典收载我国药典收载HPLC法项目和数量比较表法项目和数量比较表项目项目数数 量量1985版版1990版版1995版版2000版版2010版版鉴别鉴别934150检查检查1240160含量含量测定测定7601173871385色谱柱类型色谱柱类型 品种数品种数C18柱柱1210个个C8柱柱93个个氰基柱氰基柱21个个硅胶柱硅胶柱31个个苯基柱苯基柱9个个色谱柱类型色谱柱类型品种数品种数氨基柱氨基柱5个个丁基柱丁基柱3个个三甲基硅烷三甲基硅烷柱柱2个个二羟基丙基硅烷键合二羟基丙基硅烷键合硅胶硅胶柱柱1个个苯乙烯苯乙烯-二乙烯基二乙烯基柱柱1个个20102010版药典二部中色
22、谱柱的使用情况版药典二部中色谱柱的使用情况缬沙坦缬沙坦a-酸性糖蛋白柱酸性糖蛋白柱盐酸帕罗西汀盐酸帕罗西汀瑞格列奈瑞格列奈手性色谱柱手性色谱柱1酸性蛋白柱酸性蛋白柱瑞格列奈片瑞格列奈片苯磺酸顺阿曲库铵苯磺酸顺阿曲库铵手性色谱柱手性色谱柱chiralcel OD-RH注射用苯磺酸顺阿曲库铵注射用苯磺酸顺阿曲库铵甲氨蝶呤甲氨蝶呤牛血清白蛋白键合硅胶柱牛血清白蛋白键合硅胶柱甲氨蝶呤片甲氨蝶呤片注射用甲氨蝶呤注射用甲氨蝶呤第六节毛细管电泳法第六节毛细管电泳法Capillary Electrophoresis一、含义一、含义电泳:电泳:在电场作用下,电解质溶液中的在电场作用下,电解质溶液中的带电质点向电
23、荷相反的电极方向迁移的带电质点向电荷相反的电极方向迁移的过程。过程。毛细管电泳:毛细管电泳:在毛细管中进行的电泳。在毛细管中进行的电泳。电泳电泳:带电粒子在电场作用下迁移:带电粒子在电场作用下迁移电渗:电渗:溶剂在电场作用下的单向流动正溶质离子所受的力:电场力正溶质离子所受的力:电场力 + + 电渗力电渗力负溶质离子所受的力:电场力负溶质离子所受的力:电场力 电渗力电渗力中性分子所受的力:电渗力中性分子所受的力:电渗力二、基本原理二、基本原理 电渗流速度是电泳流速度的电渗流速度是电泳流速度的5-7倍,混合物倍,混合物中所有的组份随电渗流朝一个方向迁移。中所有的组份随电渗流朝一个方向迁移。 流出
24、顺序:流出顺序:正离子正离子中性粒子中性粒子负离子负离子q(CZE)三、分类三、分类1 1、毛细管区带电泳、毛细管区带电泳 CZE带电粒子的迁移速度带电粒子的迁移速度= =电泳和电渗流速度的矢量和。电泳和电渗流速度的矢量和。正离子:正离子:两种效应的运动方向一致,在负极最先流出两种效应的运动方向一致,在负极最先流出中性粒子:中性粒子:无电泳,受电渗流影响,在阳离子后流出无电泳,受电渗流影响,在阳离子后流出最基本、应用广的分离模式最基本、应用广的分离模式 阴离子:阴离子:两种效应的运动方向相反;两种效应的运动方向相反;电渗流电渗流 电泳电泳时时,阴离子在负极最后流出阴离子在负极最后流出2 2、毛
25、细管凝胶电泳、毛细管凝胶电泳 CGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性,类似分子筛的作用,试样分子按其具有多孔性,类似分子筛的作用,试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散,所得峰型尖锐,大小分离。能够有效减小组分扩散,所得峰型尖锐,分离效率高。分离效率高。 蛋白质、蛋白质、DNADNA等采用等采用CGECGE能获得良好分离,能获得良好分离,DNADNA排排序的重要手段。序的重要手段。 特点:抗对流性好,散热性好,分离度极高。特点:抗对流性好,散热性好,分离度极高。 (1 1)缓冲溶液中加入离子型表面活性剂,其浓度达)缓冲溶液中加入
26、离子型表面活性剂,其浓度达到临界浓度,形成一疏水内核、外部带负电的胶束。到临界浓度,形成一疏水内核、外部带负电的胶束。3 3、 胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱(MECC ,MEKC) 在电场力的作用下,在电场力的作用下,胶束在柱中移动。胶束在柱中移动。 (2 2)电泳流和电渗流)电泳流和电渗流的方向相反,且的方向相反,且电渗流电渗流 电泳电泳 ,负电胶束以较慢,负电胶束以较慢的速度向负极移动;的速度向负极移动; (5 5)色谱与电泳分离模式的结合。)色谱与电泳分离模式的结合。 (3 3)中性分子在胶束相和溶液(水相)间分配,)中性分子在胶束相和溶液(水相)间分配,疏水性强的组分与胶束结合
27、的较牢,流出时间长;疏水性强的组分与胶束结合的较牢,流出时间长; (4 4)可用来分离中性物质,扩展了高效毛细管电)可用来分离中性物质,扩展了高效毛细管电泳的应用范围;泳的应用范围;加电渗流改性剂使电渗流反向,用于淌度很大的离子的分离,主要是无机阴离子的分离。负高压 。加阳离子表面活性剂,如十六烷基三甲基溴化铵电渗流XXXXX()()高压()()地4、 毛细管离子分析毛细管离子分析三、高效毛细管电泳仪器三、高效毛细管电泳仪器清洗清洗记录记录检检测测器器高高压压电电源源毛细毛细管管电解液电解液1、高压电源:产生、高压电源:产生030kV 稳定连续可调电压稳定连续可调电压2、进样系统进样系统进样量:毛细管长度的进样量:毛细
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