分选型流式细胞仪课件

1、BDBD公司生物科学部公司生物科学部 BD公司简介n BD是由是由Maxwell W.Becton和和Fairleigh S. Dickinson于于1897年在纽约创立的，总部设在新泽西州。年在纽约创立的，总部设在新泽西州。n 经过经过100多年的发展，多年的发展，BD已成为世界上最大的医疗技术已成为世界上最大的医疗技术及医疗设备公司之一，它以领先的技术、卓越的产品质及医疗设备公司之一，它以领先的技术、卓越的产品质量和诚实可信的服务赢得了全球用户及合作伙伴的广泛量和诚实可信的服务赢得了全球用户及合作伙伴的广泛赞誉。赞誉。n BD一直是全球最专业、产品线最全的流式细胞仪生产商一直是全球最专业、

2、产品线最全的流式细胞仪生产商和流式技术领导者。全球市场占有率达到和流式技术领导者。全球市场占有率达到80，中国市，中国市场占有率达到场占有率达到85%。 BDBD公司流式细胞仪公司流式细胞仪FACSCaliburLSRIIFACSCantoIIInfluxFACSAriaIIAccuri C6LSRFortessaFACSVerseFACSJazzBD FACSAriaIIBD FACSAriaII分选型流式细胞仪分选型流式细胞仪 20082008年最新产品年最新产品 集多种专利技术和完美设计集多种专利技术和完美设计n 流式细胞术流式细胞术(Flow Cytometry,简称简称FCM)是一种

3、快速、准是一种快速、准确、客观的同时检测直线流动状态中单个颗粒多项物理确、客观的同时检测直线流动状态中单个颗粒多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，并可以对特定群及生物学特性，加以分析定量的技术，并可以对特定群体加以分选。体加以分选。n 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物及研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物及人工合成微球等。人工合成微球等。n 流式细胞仪流式细胞仪(Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型

4、高科技仪器。术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 基本概念基本概念 液流系统液流系统 光学系统光学系统 电子系统电子系统 数据储存与分析系统数据储存与分析系统 分选系统分选系统流式细胞仪组成流式细胞仪组成Fluidics CartCytometer液流系统液流系统AIR PRESSUREBULKINJECTIONSheath TankAIR PRESSUREASPIRATEDWASTE(VACUUM)ASPIRATEDWASTE(DEGAS)SHEATHFILTER0” 9”R1Sheath RegulatorR2Sample RegulatorV17V20V5V6液流系统液流系统样

5、品流速的选择样品流速的选择 低流速：一般用于分辨率较高的分析，如低流速：一般用于分辨率较高的分析，如DNA分析分析高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，影响高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，影响分型。分型。光学系统光学系统FreqFluorescenceFSC detectorSSC and Fluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.)光信号光信号11前向角散射光信号前向角散射光信号侧向角散射光信号侧向角散射光信号荧光信号荧光信号LONG (700nm)550 Long Pass (650LP)650 Short Pass (600S

6、P)SHORT (500nm)Pass Through Filters600/100 Band Pass (600/100)Transmitted 550 nm550 - 650 nm (60050)Wavelengths Blocked650 nm550 nm650 nmShort PassLong PassBand PassLONG (700nm)550 Long Pass (650LP)650 Short Pass (600SP)SHORT (500nm)Dichroic FiltersTransmitted 550 nmDiflected 90650 nm550 nmFluorochr

7、omes Overview123电子系统电子系统光电转换器：将光信号转换成电信号光电转换器：将光信号转换成电信号 光电二极管光电二极管 光电倍增管（光电倍增管（PMT）放大器两种放大方式：放大器两种放大方式： 线性放大（线性放大（lin） 对数放大（对数放大（log）线性放大：按光强度的线性关系输出信号。用于线性放大：按光强度的线性关系输出信号。用于FSC，SSC， 细胞周期检测，细胞周期检测，SP细胞检测及分选等。细胞检测及分选等。对数放大：按光强度的对数关系输出信号。用于大多数对数放大：按光强度的对数关系输出信号。用于大多数荧光染色实验。荧光染色实验。时间( 秒)电压脉冲面积脉冲高度脉冲宽

8、度0电脉冲信号类型：电脉冲信号类型： 高度信号高度信号H 宽度信号宽度信号W 面积信号面积信号A细胞周期中粘联体区分细胞周期中粘联体区分AreaHeightThreshold阈值阈值用于屏蔽噪音信号和碎片信号，只有高于等于阀值道数的用于屏蔽噪音信号和碎片信号，只有高于等于阀值道数的信号才会被送入计算机进行处理。信号才会被送入计算机进行处理。模拟数字转换器模拟数字转换器FL2时间时间时间时间FSCFL1SSC时间FL3FL1SSCFSCFL2 时间FL4数据储存与分析系统数据储存与分析系统数据储存数据储存39,27139,271Event 1Event 2Event 3FSCSSC FITCPE

9、List-Mode Data8967530,621PE-AFITC-ATimePE-AFITC-AMay be exported as FCS fileFITC/PE双染样本双染样本数据显示数据显示 直方图（直方图（Histogram） 二维点图（二维点图（Dot Plot） 等高线图（等高线图（Contour Plot） 密度图（密度图（Density） 三维图（三维图（3D Plot）等）等 直方图：显示单一参数（横坐标）与通道细胞个数（纵坐标）直方图：显示单一参数（横坐标）与通道细胞个数（纵坐标）。一条竖线代表一个细胞信号，多竖线累加形成峰图，一个峰。一条竖线代表一个细胞信号，多竖线累加

10、形成峰图，一个峰即一类细胞。即一类细胞。 二维点图：一个点代表一个细胞信号。二维点图：一个点代表一个细胞信号。 等高线图：可显示数据信号的疏密程度。等高线图：可显示数据信号的疏密程度。 密度图：可显示信号分布的疏密程度。密度图：可显示信号分布的疏密程度。 三维图（三维图（3D Plot）等）等Aria II的喷嘴位于检测点的喷嘴位于检测点的下方，因此更换喷嘴后的下方，因此更换喷嘴后无需重新调整激光光路无需重新调整激光光路1 1检测检测2 2充电充电3 3偏转偏转4 4收集收集分选系统分选系统分析结果精准：需要高灵敏度和分辨率分析结果精准：需要高灵敏度和分辨率-石英杯流动池石英杯流动池分选细胞纯

11、度：需要对目标细胞的准确定位分选细胞纯度：需要对目标细胞的准确定位-Accudrop和和Sweetspot技技术术分选速度：保证纯度前提下高度分选分选速度：保证纯度前提下高度分选-分选速度分选速度70 ,000个细胞个细胞/秒秒分选后活性：需要整个系统各环节对细胞的保护分选后活性：需要整个系统各环节对细胞的保护-石英杯流动池，自动无石英杯流动池，自动无菌管路清洗，温控菌管路清洗，温控仪器性能状态稳定性：质控程序的监控和调整仪器性能状态稳定性：质控程序的监控和调整-CS&T仪器质控程序及仪仪器质控程序及仪器状态监控器状态监控流式细胞仪分选要素流式细胞仪分选要素高灵敏度高灵敏度-弱表达样本检测弱表

12、达样本检测Dim staining PE population visibleDim staining高灵敏度高灵敏度稀有样本检测稀有样本检测待测细胞细胞群的比例待测细胞细胞群的比例并不总是这么高并不总是这么高有时，很低有时，很低十万分之一十万分之一此时，灵敏度和分辨率至关重要此时，灵敏度和分辨率至关重要传统透射光路传统透射光路采用长通采用长通/短通滤光片短通滤光片光信号经过一次透射，信号损失光信号经过一次透射，信号损失15-20%多色分析时，荧光检测灵敏度降低多色分析时，荧光检测灵敏度降低八角形八角形/三角形接收装置三角形接收装置-BD专利专利采用全反射双色光镜采用全反射双色光镜光信号经过一

13、次反射，信号损失仅光信号经过一次反射，信号损失仅5%保证多色分析时的荧光检测灵敏度保证多色分析时的荧光检测灵敏度光电倍增管带通滤光片长通双色反光镜细胞通过激光束的流速变慢，激光细胞通过激光束的流速变慢，激光照射时间更长，提高了激光激发效照射时间更长，提高了激光激发效率率流动池被光胶耦合在荧光接收物镜流动池被光胶耦合在荧光接收物镜上，提高了荧光收集效率，保证多上，提高了荧光收集效率，保证多色应用中最佳的灵敏度和分辨率色应用中最佳的灵敏度和分辨率固定光路，无需每日调节，机器随固定光路，无需每日调节，机器随开随用，减少人为可变性，提高实开随用，减少人为可变性，提高实验重复性验重复性石英杯流动池石英杯

14、流动池 开机光路无需调整开机光路无需调整 一键式操作一键式操作 无需操作者的丰富经验无需操作者的丰富经验 实验结果的可重复性好实验结果的可重复性好实测检测灵敏度：实测检测灵敏度：FITC: 10 MESF PE:10 MESF实测分辨率：实测分辨率：CV=1.6% 二极管激光器，安装在分选模块装置左侧二极管激光器，安装在分选模块装置左侧 可以提供侧液流图像的照相机可以提供侧液流图像的照相机 用于观察用于观察BD AccudropTM 微球荧光的发射光滤光片微球荧光的发射光滤光片Accudrop微球是一种荧光微球，被位于偏转板微球是一种荧光微球，被位于偏转板下方的红激光激发后，发射光可以透过侧液

15、流监下方的红激光激发后，发射光可以透过侧液流监视器前方的滤光片，用于测量视器前方的滤光片，用于测量drop delay。该系。该系统由统由下列部分构成：下列部分构成：Interrogation pointDrop delayBreakoffNozzle+Cells injected+-LaserDrop delay定义：定义：Drop delay即液滴延迟时即液滴延迟时间间，指细胞通过检测区到液滴分离，指细胞通过检测区到液滴分离的间隔时间的间隔时间 意义：意义： Drop delay如果能够被准如果能够被准确确定，就可以保证包裹细胞的液滴确确定，就可以保证包裹细胞的液滴表面不会充上相反的电荷，

16、表面不会充上相反的电荷，从而实现从而实现最高的分选纯度及细胞得率最高的分选纯度及细胞得率耗时：耗时：0.5到到1.5小时小时辅助材料：荧光微球、荧光显微镜、辅助材料：荧光微球、荧光显微镜、 玻片、计算器玻片、计算器传统液滴延迟时间确定传统液滴延迟时间确定BD 独有专利独有专利 Accudrop 技术：技术： Accudrop微球是一种荧光微球，被微球是一种荧光微球，被位于偏转板下方的红激光激发后，发射光可以透过侧液流监视器前位于偏转板下方的红激光激发后，发射光可以透过侧液流监视器前方的滤光片，用于测量方的滤光片，用于测量drop delay。预先分选预先分选Accudrop荧光微球荧光微球自动

17、准确设置最佳液滴延迟时间自动准确设置最佳液滴延迟时间无需手动调节，减少人为误差无需手动调节，减少人为误差保证实验的分选纯度和得率保证实验的分选纯度和得率Sweet Spot自动监控自动监控功能功能 液滴断点监测窗口液滴断点监测窗口 自动调节振幅，维持断点稳定自动调节振幅，维持断点稳定 维持维持最佳液滴延迟状态最佳液滴延迟状态 仪器阻塞报警，保护分选样本不受污染仪器阻塞报警，保护分选样本不受污染，实现分选时无人看管，实现分选时无人看管分选模式分选模式 Yield Mask：如果目标颗粒位于该设定范围内，则含有目标颗粒的液滴和相邻的液滴都被分选。 Purity Mask：如果非目标颗粒位于该设定范

18、围内，则与其相邻的含有目标颗粒的液滴将不被分选。 Phase Mask：如果目标颗粒位于该设定范围内，则含有目标颗粒的液滴将不被分选。AccudropPlate sortingEnrichment2-Way sorting4-Way sorting影响分选细胞的活性的因素：影响分选细胞的活性的因素： 细胞本身细胞本身 激光功率激光功率 液路系统（喷嘴）液路系统（喷嘴） 分选系统的洁净程度及温度控制分选系统的洁净程度及温度控制石英杯激发保证了用小功率激石英杯激发保证了用小功率激光的效率远远大于大功率空气光的效率远远大于大功率空气激发的效率，光毒性小，很好激发的效率，光毒性小，很好的保证细胞活性。

19、的保证细胞活性。稳定而零剪切力液流系统设计最大程度的保稳定而零剪切力液流系统设计最大程度的保证了细胞的活性，同时专利的喷嘴设计，进证了细胞的活性，同时专利的喷嘴设计，进一步保证了细胞活性。一步保证了细胞活性。既有样本温控系统也有收集仓温控既有样本温控系统也有收集仓温控Aria 自动无菌消毒清洗自动无菌消毒清洗软件向导清洗自动执行软件向导清洗自动执行无菌分选结果保证，文献支持无菌分选结果保证，文献支持 全自动标准化的无菌清洗流程，密闭式的上全自动标准化的无菌清洗流程，密闭式的上样和分选收集仓，执行一次可以保证整个管样和分选收集仓，执行一次可以保证整个管路系统在以后连续路系统在以后连续4天内菌量为

20、天内菌量为0的最佳效果。的最佳效果。采用一管采用一管CS&T微球，方便检测微球，方便检测微球染料可以被任意激光激发，涵盖常微球染料可以被任意激光激发，涵盖常用染料荧光波谱用染料荧光波谱自动调整自动调整PMT报告仪器性能参数：报告仪器性能参数：Qr，Br，CV，跟，跟踪仪器状态踪仪器状态自动调整激光延迟和面积因子自动调整激光延迟和面积因子BD公司专利技术公司专利技术Cytometer Setup & Tracking SystemCS&T仪器质控程序及仪器状态监控仪器质控程序及仪器状态监控流式细胞术操作流程流式细胞术操作流程 样品制备样品制备 流式染色、检测流式染色、检测 数据分析数据分析细胞悬

21、液的制备细胞悬液的制备 单细胞悬液（天然，机械研磨单细胞悬液（天然，机械研磨/ /消化）消化） 5 510105 51 110106 6cells/mlcells/ml，约，约0.50.51ml1ml，300300目筛网过滤目筛网过滤 阴性对照：阴性对照：自发荧光自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。荧光。自发荧光信号为噪声信号。 同型对照：同型对照：自发荧光非特异荧光自发荧光非特异荧光，使用与一抗相同种属来源、相同亚，使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合产生

22、的背型、相同剂量的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合产生的背景染色景染色 实验样本：实验样本：自发荧光特异荧光非特异荧光自发荧光特异荧光非特异荧光 补偿对照：补偿对照：双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时，双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时，使用单种荧光使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行染色，素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行染色，纠正荧光素发射光谱重叠，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他纠正荧光素发射光谱重叠，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号的干扰荧光信号设置对照及染色设置对照及染色 用同型对照或阴用

23、同型对照或阴性对照管调节电性对照管调节电压使阴性群位于压使阴性群位于“左下角左下角” 用单阳性管依次用单阳性管依次调节相邻荧光之调节相邻荧光之间补偿，如间补偿，如 FL1-%FL2， FL2-%FL1 染色体分选染色体分选 单克隆细胞分选单克隆细胞分选 肿瘤干细胞分选肿瘤干细胞分选 转染细胞分选转染细胞分选 免疫或免疫相关细胞分选免疫或免疫相关细胞分选 细胞生理学研究细胞生理学研究 细胞膜表面标记细胞膜表面标记 细胞内标记细胞内标记 细胞周期分析细胞周期分析 凋亡分析凋亡分析 流式细胞术的应用流式细胞术的应用细胞生理学研究细胞生理学研究 细胞相对大小和颗粒性分析细胞相对大小和颗粒性分析细胞生理学研究细胞生理学研究 细胞内细胞内PHPH值检测值检测细胞生理学研究细胞生理学研究 CaCa2+2+流动性检测：流动性检测：CaCa2+2+是非常重要的细胞内离子，在细是非常重要的细胞内离子，在细胞膜到细胞浆的信号传导中起重要的作用。细胞受到刺胞膜到细胞浆的信号传导中起重要的作用。细胞受到刺激后，胞内激后，胞内CaCa2+2+浓度会发生改变。浓度会发生改变。 最常用的染料：最常用的染料：Indo-1,Fluo-3,Fura redIndo-1,Flu