第五章_分子发光分析法(好)

1、 萤火虫发光萤火虫发光第四章 分子发光分析法4.2 分子荧光与磷光光谱分析法分子荧光与磷光光谱分析法4.3 化学发光分析法化学发光分析法4.1 概论概论本章学习要求掌握掌握分子荧光光谱法、分子磷光光谱法和化学分子荧光光谱法、分子磷光光谱法和化学发光分析的基本原理；发光分析的基本原理；熟悉熟悉影响荧光、磷光及化学发光强度的因素；影响荧光、磷光及化学发光强度的因素；了解三种光谱仪的基本组成部件及其作用；了解三种光谱仪的基本组成部件及其作用；熟悉三种方法的基本应用。熟悉三种方法的基本应用。 16 16世纪人们发现紫外和可见光照射到某些物质时，这世纪人们发现紫外和可见光照射到某些物质时，这些物质会发光

2、，当光照停止时，物质发光会停止。些物质会发光，当光照停止时，物质发光会停止。18521852年年斯托克斯斯托克斯（stokes) stokes) 进行了解释。进行了解释。18671867年年GoppelsroderGoppelsroder应用铝应用铝- -桑色素络合物的荧光对铝进桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。行了测定。现在已是一种重要的分析方法现在已是一种重要的分析方法4.1 概论物质分子吸收能量跃迁到电子激发态后，在返回物质分子吸收能量跃迁到电子激发态后，在返回基态的过程中伴随有光辐射，这种现象称为基态的过程中伴随有光辐射，这种现象称为分子发分子发光光，以此建立起来的分析方法称为，以此建

3、立起来的分析方法称为分子发光分析法分子发光分析法。分子发光分析分子发光分析法法 光致发光分析（）光致发光分析（） 电致发光分析（）电致发光分析（） 化学发光分析（）化学发光分析（） 生物发光分析（）生物发光分析（）分子发光分析法的特点分子发光分析法的特点(1)灵敏度高: 比吸收光度高23个数量级。(2)选择性比较高: 物质吸光后能有发光现象的不多，且吸收波长和发射波长也不同，可通过调节激发波长和发射波长进行选择性测定。(3)试样量小，操作简便，工作曲线的动态线性范围宽。 (4) 在光学分子传感器以及在生物医学、药学和环境科学等方面的应用优越性显著。一、荧光和磷光的产生 当一个电子被激发时，通常

4、跃迁至第一激发轨道上，也可能跃迁到能级更高的单重态上。处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态，辐射跃迁主要包括荧光、延迟荧光或磷光的发射。4.24.2 分子分子荧光与磷光光谱分析法荧光与磷光光谱分析法一、荧光和磷光光谱的产生 具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁产生荧光和磷光 基态分子 价电子跃迁到激发态光照激发光照激发去激发光去激发光 * * n 、n n去激发光去激发光 * * n分子能级与跃迁分子能级与跃迁基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射(是量子化的)；跃迁一次到位；第一、第二、电子激发单重态 S1 、S2 ； 第一、第二

5、、电子激发三重态 T1 、 T2 ；激发态基态：多种途径和方式(见图8-1)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜跃内转化振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转移l l 2T2内转化振动弛豫2.电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：M M=2=2S S+1+1： 当当S S0 0时，即时，即M=2SM=2S1 11 1，称为，称为单重态单重态 当当S S1 1时，即时，即M=2SM=2S1 13 3，称为，称为叁重态叁重态 大多数基态分子处于单重态，表示为大多数基态分子处于单重态，表示为S S0 0

6、（基态单重态）（基态单重态）S0T1 为禁阻跃迁；必须通过其他途径(系间窜越)进入，进入的几率小； 根据洪特规则，平行自旋比成对自旋稳定；而三根据洪特规则，平行自旋比成对自旋稳定；而三重态能级比相应单重态能级低，所以平均寿命长。重态能级比相应单重态能级低，所以平均寿命长。注：注：1 1、单重态有抗磁性；叁重态有顺磁性。、单重态有抗磁性；叁重态有顺磁性。 2 2、多数分子含有偶数电子，分子的电子基态、多数分子含有偶数电子，分子的电子基态多为单重态；没有基态叁重态。多为单重态；没有基态叁重态。 3 3、从、从S S0 0到到T T1 1的跃迁是禁阻的。的跃迁是禁阻的。 4 4、E (SE (S1

7、1)E (T)E (T1 1) )。3.激发态基态的能量传递途径 电子从激发态返回基态时失去能量方式：电子从激发态返回基态时失去能量方式：传递途径传递途径辐射跃迁荧光磷光内转移外转移系间窜越振动弛豫非辐射跃迁第一激发三重态三重态的最低振动能级基态各振动能级。第一激发单重态单重态的最低振动能级基态各振动能级。 振动施豫振动施豫(VR): (VR): 同一电子能级同一电子能级中，电子由高振动能级转移至低中，电子由高振动能级转移至低振动能级而将多余的能量以热的形式发出，振动施豫时间为振动能级而将多余的能量以热的形式发出，振动施豫时间为1010- -1212s s。 内转移内转移(ic) (ic) ：

8、当：当两个电子能级两个电子能级非常靠近以致其振动能级有非常靠近以致其振动能级有重叠重叠时，常发生有高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。时，常发生有高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。 外转移外转移：激发分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转：激发分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移而去活的过程称外转移。移而去活的过程称外转移。使荧光或磷光强度减弱或消失的过程（使荧光或磷光强度减弱或消失的过程（熄灭或淬灭熄灭或淬灭）。）。系间窜越系间窜越跃迁跃迁(isc) (isc) ：指：指不同多重态不同多重态间的无辐射跃迁。改变电间的无辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁。子自旋，禁阻跃迁。 非辐射

9、能量传递过程非辐射能量传递过程S2S0S1T1l2l1振动弛豫（振动弛豫（VR）：）：同一电子能级同一电子能级内以热能量交换形式由内以热能量交换形式由高振高振动能级至低相邻振动动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间1010 -12-12-10-10-14-14s s。特点特点：无辐射；速率快：无辐射；速率快（10-1410-12 s内完成）内完成）内转移（内转移（ic） ：相同多重态相同多重态的的两个电子能级两个电子能级之间（如之间（如S2 S1）的非辐射跃迁）的非辐射跃迁 。S2S0S1T1l2l1内转移内转移的特点的特点（1）无辐射；）无辐射；（

10、2）速率取决于两个能级之间的能量差，相邻单重激）速率取决于两个能级之间的能量差，相邻单重激发态之间能级接近，振动能级常常发生重叠，内转移发态之间能级接近，振动能级常常发生重叠，内转移很快；很快；（3）分子无论被激发到哪一个电子激发态，在）分子无论被激发到哪一个电子激发态，在10-1310-11 s内经内转移和振动弛豫都会跃迁到最低的电子激内经内转移和振动弛豫都会跃迁到最低的电子激发态的最低振动能级上；发态的最低振动能级上；（4）So到到S1的能级差较大，内转移的速率相对较小，的能级差较大，内转移的速率相对较小，故故S1的寿命较长。的寿命较长。磷光发射磷光发射Phosphorescencel3S

11、2系间窜跃系间窜跃S0S1T1l2l1Intersystem Crossing体系间窜跃（体系间窜跃（ isc ）：不同多重态不同多重态, ,有重叠的转动能级间的非辐有重叠的转动能级间的非辐射跃迁（射跃迁（ S S1 1TT1 1跃迁）跃迁） 。荧光发射荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（多为基态（多为 S S1 1 S S0 0跃迁跃迁），），发射波长为发射波长为 l l 2 2的荧光的荧光 1010-8-810 10 -10-10 s s 。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长

12、；l l 2 2 l l 2 2 l l 1 1 ；磷光发射磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级电子由第一激发三重态的最低振动能级基态基态（T T1 1 S S0 0跃迁跃迁）；）； 电子由电子由S S0 0进入进入T T1 1的可能过程：（的可能过程：（ S S0 0 T T1 1禁阻跃迁）禁阻跃迁） S S0 0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T T1 1 发光速度很慢：发光速度很慢： 1010-4-410s 10s 。 光照停止后，可持续一段时间光照停止后，可持续一段时间辐射能量传递过程S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光

13、光系间窜跃内转化振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转移l l 2T2内转化振动弛豫4、荧光、磷光的寿命和量子产率（发光参数）荧光寿命（f f）：荧光分子处于S1激发态的平均寿命。f f1/(k1/(kf fK)K)（ 10-810 -10 s ） 磷光寿命磷光寿命（p p ）：磷光分子处于T1激发态的平均寿命。P P1/(k1/(kP PK) K) （ 10-410s ）强度的衰变强度的衰变： lnIlnI0 0-lnI-lnIt t = t/= t/作出lnIt t关系曲线，由所得直线的斜率可计算得到荧光（或磷光）的寿命值。 荧光量子产率荧光量子产率（f）：荧光物质吸光后所发射的

14、荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值。f fk kf f/(k/(kf fKKi i) )磷光的量子产率磷光的量子产率（p）: jPPSTPkkkK Kf f 为荧光发射过程的速率常数，为荧光发射过程的速率常数，K Ki i为非辐射跃迁的速率常数之和。为非辐射跃迁的速率常数之和。 一般来说：一般来说：K Kf f主要取决于物质的化学结构主要取决于物质的化学结构K Ki i主要取决于化学环境。荧光效率在主要取决于化学环境。荧光效率在0.1-1.00.1-1.0之间之间二、荧光、磷光与分子的关系 许多物质能够吸收紫外和可见光，但只有一部分物质能发荧光或磷光很大程度上决定于分子结构。强荧光性物

15、质的分子结构特征：P.211212(1)共轭效应共轭效应：具有大的共轭双键(键）体系；(2)刚性平面结构刚性平面结构：具有刚性的平面构型可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用；(3)取代基效应取代基效应：环上的取代基是给电子取代基团；(4)跃迁类型跃迁类型：其最低的电子激发单重态为（，）型。（1）共轭双键体系）共轭双键体系 分子中必须含有共轭双键；分子中必须含有共轭双键；共轭体系越大共轭体系越大， 电子电子的离域性越强，越易被激发而生荧光（荧光效率高）且的离域性越强，越易被激发而生荧光（荧光效率高）且荧光峰向长波方向移动。荧光峰向长波方向移动。芳香族化合物易产生荧光芳香族化合物易产生荧光，注，注

16、意：能够发荧光的脂肪族和脂环族化合物极少。意：能够发荧光的脂肪族和脂环族化合物极少。Ff: 0.29；f310nmFf: 0.46；f310nm再如：再如：Ff: 0.28Ff: 0.68(CHCH)3(CHCH)2共轭体系增加，荧光效率增大！共轭体系增加，荧光效率增大！（2）荧光物质的刚性和共平面性增加）荧光物质的刚性和共平面性增加，可使分子与溶，可使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减小（即剂或其它溶质分子的相互作用减小（即外转移外转移能量损失能量损失减小），有利于荧光发射。减小），有利于荧光发射。例例1：Ff: 0.20Ff: 1.0Fluorene（芴）例例2：8羟基喹啉（弱荧光），当

17、与羟基喹啉（弱荧光），当与Mg2+络合后，为络合后，为强荧光物质，可用刚性结构的影响解释。强荧光物质，可用刚性结构的影响解释。例例3 ：红色荧光红色荧光滂铬滂铬BBR，无荧光，无荧光N=NOHOHSO3NaN=NSO3NaAlOOH2OOH2空间取代基效应空间取代基效应O3SN(CH3)2N(CH3)2SO3F Ff0.75F Ff0.03扭转离开了平面构型，影响了扭转离开了平面构型，影响了p- 共轭作用共轭作用立体异构现象立体异构现象无荧光无荧光强荧光强荧光CHCHCHCH（3）取代基效应）取代基效应（i）给电子的取代基给电子的取代基：如：如OH，NH2，NR2，OR等，等，p- 共轭，共轭

18、，使荧光增强使荧光增强。如：苯胺、苯酚。如：苯胺、苯酚苯，苯，（ii）吸电子的取代基吸电子的取代基：如：如NO2，COOH，NO等等使荧光减弱使荧光减弱。如：硝基苯为非荧光物质。如：硝基苯为非荧光物质。（iii）卤素取代卤素取代基随原子序数的增加，物质的基随原子序数的增加，物质的荧光减弱，荧光减弱，而磷光增强而磷光增强（重原子效应：重原子效应：重原子取代促进了荧光体中的电子自旋重原子取代促进了荧光体中的电子自旋-轨道的偶合作用，系间窜越轨道的偶合作用，系间窜越S1T1概率大）。概率大）。三、影响分子发光的环境因素1溶剂的影响荧光体的基态与激发态的偶极矩不同，与溶剂分子的偶极之间存在的静电相互作

19、用也不同；激发时发生跃迁，激发态的极性更大，若溶剂极性增大，荧光光谱向长波方向移动；荧光体与溶剂之间发生了特殊的化学作用（如形成氢键）。溶剂溶剂相对介电常数相对介电常数荧光峰荧光峰l/l/nmnm荧光效率荧光效率乙腈乙腈38.838.84104100.0640.064丙酮丙酮21.521.54054050.0550.055氯仿氯仿5.25.23983980.0410.041四氯化碳四氯化碳2.242.243903900.0020.002巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率2介质酸碱性的影响 如果荧光物质是一种有机弱酸或弱碱，介质的酸碱性变化将对荧光光谱的

20、形状和强度产生影响。酸性基团的解离作用或碱性基团的质子化作用，可能改变与发光过程相竞争的非辐射跃迁过程的性质和速率，从而影响到化合物的发光特性。测定金属离子时，改变溶液的pH将会影响到金属离子与有机试剂所生成的发光络合物的稳定性和组成，从而影响它们的发光性质。pH 的影响OHO-pH1有荧光pH13无荧光NH2NH3+H+pH4.8-3.4蓝色荧光无荧光O-+H+SO3OHO3S-无 荧 光蓝 色 荧 光pH6.47.43介质的温度和黏度的影响 温度对于溶液的荧光强度尤其是对磷光强度有着显著的影响。温度升高，溶液的荧光和磷光强度下降。 介质黏度的提高，将减小激发态分子振动和转动的速率，从而降低

21、了与其他溶质分子的碰撞概率，有利于提高荧光或磷光的强度。4有序介质的影响 有序介质（表面活性剂或环糊精溶液）对发光分子的发光特性有着显著的影响。 在表面活性剂的胶束溶液中，发光分子被分散进入胶束的内核或栏栅部位，或者被束缚在胶束-水界面，降低了发光分子活动的自由度并起了屏蔽作用，对发光物质起了增溶、增敏和增稳作用，减小了非辐射衰变过程的速率，提高了发光强度。5、O2的存在：的存在： O2为顺磁性分子，溶液中溶解氧的存在，使激为顺磁性分子，溶液中溶解氧的存在，使激发单重态分子向三重态的系间窜跃速率加大，导致发单重态分子向三重态的系间窜跃速率加大，导致荧荧光效率降低光效率降低，甚至熄灭。其它顺磁性

22、物质也有这种作，甚至熄灭。其它顺磁性物质也有这种作用。用。四、荧光磷光的猝灭（P.214216）发光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用，引起发光强度下降或消失的现象称为荧光（磷光）猝灭。 猝灭剂：与发光分子相互作用而引起发光强度下降的物质。动态猝灭：猝灭过程发生于猝灭剂与发光物质的激发态分子之间的相互作用，以能量转移的机制或电荷转移的机制丧失其激发能而返回基态。静态猝灭：猝灭过程发生于猝灭剂与发光物质的基态分子之间的相互作用，所产生的络合物在实际检测的光谱区内不发光。五、激发光谱和发射光谱 1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 固定待观测的发射波长，改变激发光（入射光）波长，根据化合物发射的荧光(

23、磷光)强度与激发光波长的关系得激发光谱曲线 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。2.荧光发射光谱(或磷光光谱) 固定激发光波长(选最大激发波长),扫描发射光波长，根据化合物发射的荧光(或磷光)强度与发射光波长关系得到的曲线(图中曲线II或III)。200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱3.激发光谱与发射光谱的关系a. Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，是振动弛豫消耗了能量。b. 发射光

24、谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图l 2 ,l 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如l2 )。 c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称关系。 镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；每一个吸收能级对应一个发射峰，构成镜像关系。 在有些情况下，吸收的光完全以声子的形式释放，则在发射峰中没有对应的峰，这也是完全可以的。也就是说，镜像关系并不总是成立的 。 每一个吸收能级对应一个发射峰，构成镜像关系。原则上，如果一个电子从一个能级吸收能量跃迁到另

25、一个能级，产生一个吸收峰，再释放出来，形成一个发射峰，这种匹配是合理的。如果电子处于激发态时不经驰豫(relaxation)直接反回基态，那激发峰和发射峰是完全重叠的；但事实上，处于激发态的电子往往要经过驰豫，释放声子（热运动），然后再回到基态，因此产生了Stokes位移，此时产生的发射峰波长长于激发波长，构成了一一对应的镜像关系。在有些情况下，吸收的光完全以声子的形式释放，则在发射峰中没有对应的峰，这也是完全可以的。也就是说，镜像关系并不总是成立的。 200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱六.

26、荧光（磷光）强度与溶液浓度的关系u荧光强度荧光强度 If 正比于正比于吸收的光吸收的光强度强度Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 f ： If f Ia 由比耳定律：由比耳定律： Ia I0-It I0 (1-10- b c ) If f I0(1-10- b c ) f I0(1-e-2.3 bc ) 浓度很低时，将括号项近似处理后（浓度很低时，将括号项近似处理后（P.218）If 2.3 f I0 b c Kc （荧光定量关系式荧光定量关系式）u磷光强度磷光强度Ip: Ip=2.3 ST pI0 b c Kc （磷磷光定量关系式）光定量关系式） 随着溶液浓度的进一步增大，将会出现发光强度不仅

27、不随溶液浓度线性增大、甚至出现随浓度的增大而下降的浓度效应。 发光的再吸发光的再吸：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波短端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；七、荧光、磷光分析仪器（一）荧光分析仪器（一）荧光分析仪器四部分四部分组成：激发光源、双单色器系统、试样池、检测器。组成：激发光源、双单色器系统、试样池、检测器。 特殊点特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。光源光源：高压氙灯、汞灯、激光二极管、激光光源。单色器单色器：光栅和滤光片；含选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的

28、第二单色器；试样池：试样池：长、宽各为Icm的柱型石英液池，与流动注射分析技术联用时则用石英微流通池。检测器检测器：光电倍增管、CCD检测器 。同步扫描技术同步扫描技术可简化光谱同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率。合适的合适的ll可可减少光谱重叠减少光谱重叠；如：酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但l60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。（二）磷光分析仪器（二）磷光分析仪器l如果试样只发磷光，可在荧光分光光度计上直接测定。l若试样发荧光也发磷光，则必须在荧光分光光度计上配上“磷光镜” 将荧光隔开后，再测定磷光的。 荧光计配上磷光测量附件，即

29、可在有荧光发射的同时测量磷光。试样池： 在低温磷光分析中，通常将试液装入内径约 13 mm的石英细管（液池）中，然后将液地插入盛有液氮的杜瓦瓶内（图85）。固体表面室温磷光分析基于测量室温下吸附于固体表面的分析物所发射的磷光。将裁剪成合适大小的滤纸贴附在玻璃载片上，在滤纸中心的合适位置上滴加极小量的试液，适当烘干后再滴加所需要的试剂溶液，再经适当烘干，然后将载片放入试样室，使载片附有试样的一面与入射光的方向成45o，并且滤纸上的试样点必须落在入射光的照射范围内。八、荧光和磷光的常规测定方法（一）（一）荧光的常规测定方法（P.223224）1.1. 直接测定法（标准曲线法）直接测定法（标准曲线法

30、）配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。2.2. 间接测定法间接测定法荧光衍生法荧光猝灭法敏化荧光法 3.3. 多组分混合物分析多组分混合物分析通过选择合适的激发波长或发射波长测定混合物中某种组分。采用同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定等方法来达到分别测定或同时测定的目的。1.1.低温磷光分析低温磷光分析在低温（液氮）条件下测量磷光。所用溶剂的要求：在液氮温度下具有足够的黏度并能形成明净的刚性玻璃体，对分析物具有良好的溶解特性，在所研究的光谱区内没有很强的吸收和发射，容易制备和提纯。2.2.室温磷光分析（室温磷光分析（RTPRTP） 固体基质表面室温磷光分析（SSRTP） 胶束稳定的室温磷光分析（MSRTP） 敏化室温磷光分析（SRTP）（二）磷（二）磷光的测定方法（P.224226）4.3化学发光分析法化学发光是由化学反应提供的能量激发物质所产生的光辐射。生物发光是指产生于生物体系中的化学发