动物分子克隆载体

1、第第 七七 节节动物分子克隆载体动物分子克隆载体 一一. 构建动物克隆载体的病毒种类和特征构建动物克隆载体的病毒种类和特征病毒类型病毒类型 例子例子 病毒大小病毒大小(nm) 基因组结构基因组结构 基因组大小基因组大小(kb)细小病毒细小病毒 野生型野生型 H-1,RV,MVM 20 ss-DNA 1.8-2.7 缺陷型缺陷型 AAV 乳多空病毒乳多空病毒 乳实瘤乳实瘤 兔兔,人人(BPV) 30-50 环状环状ds-DNA 4.5-7.5 多型瘤多型瘤 小鼠肿瘤小鼠肿瘤 空泡空泡 SV40，BKV腺病毒腺病毒 人人(AD) 80-90 ds-DNA 30-40 疱疹病毒疱疹病毒 HSV,EB

2、V 100-150 ds-DNA 80-140痘病毒痘病毒 300200100 ds-DNA 240-300逆病毒逆病毒 MLV,MSV 100-120 ss-RNA 8.5 二二. 病毒型载体病毒型载体 1. 特点特点1) 可在动物细胞中形成病毒颗粒（形态构成组分来自可在动物细胞中形成病毒颗粒（形态构成组分来自天然病毒或原病毒细胞）天然病毒或原病毒细胞） 2) DNA转移效率高，但必须与天然转移效率高，但必须与天然(辅助辅助)病毒共感染病毒共感染动物细胞动物细胞 3) 大多数被感染动物细胞将是致死的，但有少数病毒大多数被感染动物细胞将是致死的，但有少数病毒（如逆病毒）载体可稳定整合到染色体（

3、如逆病毒）载体可稳定整合到染色体DNA中。中。 4) 插入病毒载体的外源基因只能在动物细胞中作瞬时插入病毒载体的外源基因只能在动物细胞中作瞬时表达表达 2. 载体种类载体种类 根据构建载体的病毒基因大小可分为两类：根据构建载体的病毒基因大小可分为两类： 1）复制型复制型：由小分子病毒：由小分子病毒DNA 构建而成，具复制起点，构建而成，具复制起点，其克隆位点可在病毒其克隆位点可在病毒DNA之内，亦可在病毒之内，亦可在病毒DNA之外，这之外，这类载体有的容量十分有限（如类载体有的容量十分有限（如SV40），有的则很大（如），有的则很大（如HSV），其容量大小主要取决于病毒外壳蛋白的包装能力。），

4、其容量大小主要取决于病毒外壳蛋白的包装能力。 2）非复制型非复制型：这类载体是在细菌克隆载体中插入一段：这类载体是在细菌克隆载体中插入一段病毒病毒DNA（不含复制起点）。当外源（不含复制起点）。当外源DNA插入该载体后，插入该载体后，与相应的天然病毒一起感染动物细胞，外源与相应的天然病毒一起感染动物细胞，外源DNA可借助两可借助两病毒病毒DNA同源部分的重组插入天然病毒。这类载体特别适同源部分的重组插入天然病毒。这类载体特别适合于那些较大的病毒合于那些较大的病毒DNA分子。分子。 实例实例：痘病毒长：痘病毒长180kb,编码编码150多种多肽，整个生存阶段多种多肽，整个生存阶段均在细胞质内，它

5、能合成均在细胞质内，它能合成DNA复制、转录和转录后修饰的复制、转录和转录后修饰的各种酶类，由此病毒构建的非复制型载体就是在细菌载体各种酶类，由此病毒构建的非复制型载体就是在细菌载体中插入一段痘病毒中插入一段痘病毒DNA.三三. 质粒型载体质粒型载体1. 特点特点：不能形成病毒颗粒，以高拷贝质粒形式存在于动物不能形成病毒颗粒，以高拷贝质粒形式存在于动物细胞内，不导致动物细胞死亡。细胞内，不导致动物细胞死亡。 2. 组成组成：pMB1和病毒复制起点（如和病毒复制起点（如SV40，BPV，EBV等），等），适合于细菌和动物细胞的选择标记基因。适合于细菌和动物细胞的选择标记基因。3. 实例实例 1)

6、 SV40质粒载体质粒载体 SV40具如下物理图谱，具如下物理图谱，5243bp, 为两种抗原（为两种抗原（T-和和t-抗原）和抗原）和三种病毒衣壳蛋白编码。其中三种病毒衣壳蛋白编码。其中T-抗原参与抗原参与SV40的有效感染，并的有效感染，并能特异地结合在病毒能特异地结合在病毒DNA复制起点上，这种结合对复制起点上，这种结合对DNA复制是复制是必须的。因复制起点与该基因的启动子顺序相近，故它本身的表必须的。因复制起点与该基因的启动子顺序相近，故它本身的表达也受到达也受到T-抗原的控制。抗原的控制。 当含当含SV40复制起点的质粒型载体或重组复制起点的质粒型载体或重组DNA分子转入分子转入CO

7、S细胞后细胞后(含有含有SV40的的T-抗原抗原)可大量复制可大量复制, 其拷贝数可达其拷贝数可达20-40万。万。SV40T-抗原t-抗原VP2VP3VP1ORBEp342E(4.9 kb)HBSAgAprSV40质粒载体质粒载体 2) BPV-1质粒载体质粒载体 BPV-1中中69T是转化动物细胞所必需的是转化动物细胞所必需的, 约占该病毒约占该病毒DNA总长总长的的69%, 单向转录。由单向转录。由69T和和E.coli质粒载体构成穿梭质粒载体。质粒载体构成穿梭质粒载体。BPV-1(7956bp)L1L2E1E269THBpBPV-tk(11.6kb)BPV质粒载体质粒载体三三. 整合型

8、载体整合型载体 这类载体可借助同源重组作用使外源基因插入染色体或病这类载体可借助同源重组作用使外源基因插入染色体或病毒基因组中。毒基因组中。 1. 逆病毒克隆载体逆病毒克隆载体 1) 逆病毒用于载体的优点逆病毒用于载体的优点: i. 基因组小基因组小, 易于操作易于操作 ii. 高滴度高滴度, 易于导入细胞易于导入细胞 iii. 准确整合入受体细胞染色体中准确整合入受体细胞染色体中, 外源基因可稳定表达，外源基因可稳定表达，具有具有强转录增强子强转录增强子, 可在多种细胞中高效表达外源基因可在多种细胞中高效表达外源基因 2) 逆病毒载体的用途逆病毒载体的用途 i. 基因治疗基因治疗 ii. 在

9、胚胎组织中研究特定基因的发育功能在胚胎组织中研究特定基因的发育功能 iii. 可用作家系标记可用作家系标记 iv. 导入生殖细胞或胚胎干细胞导入生殖细胞或胚胎干细胞, 产生转基因动物产生转基因动物 v. 用作插入突变剂用作插入突变剂 vi. 用于逆病毒分子生物学研究用于逆病毒分子生物学研究 3) 逆病毒的生活史和基因组结构逆病毒的生活史和基因组结构 生活史生活史: 病毒粒子感染病毒粒子感染 反转录为线状反转录为线状ds-DNA 整合到染色体整合到染色体中转录为中转录为2个个mRNA分子分子 翻译成病毒蛋白翻译成病毒蛋白 包装成病包装成病毒粒子毒粒子 释放到细胞外释放到细胞外 结构结构: i.

10、长末端重复长末端重复(long terminal repeat, LTR) ii. 正链和反链引物序列正链和反链引物序列PB(-), PB(+) iii. 包装序列包装序列(gag基因编码区基因编码区5-端端420 bp序列序列) iv. 反式作用基因反式作用基因: gag核心蛋白核心蛋白; pol反转录酶反转录酶/整合酶整合酶; env-外壳糖蛋白外壳糖蛋白 v. RNA剪接供体和受体序列剪接供体和受体序列SD, SA 4) 逆病毒的宿主范围逆病毒的宿主范围 i. 种特异性种特异性-窄谱窄谱(ecotrophic): 如如M-MLV仅限于鼠细胞；广仅限于鼠细胞；广谱谱(amphotropic

11、): 如如MLV在鸟和哺乳动物细胞在鸟和哺乳动物细胞, 用用M-MLV所构建的载体也可具广谱性所构建的载体也可具广谱性, 只要用广谱逆病毒的外壳蛋白只要用广谱逆病毒的外壳蛋白包装即可包装即可 ii. 组织特异性组织特异性-成纤维细胞成纤维细胞, 淋巴细胞淋巴细胞, 上皮细胞上皮细胞 iii. 免疫性免疫性 5) 逆病毒克隆载体逆病毒克隆载体 i. 单基因载体单基因载体 仅保留逆病毒的仅保留逆病毒的LTR序列序列, 无标记基因无标记基因 ii. 双基因载体双基因载体: 剪接载体剪接载体; 内启动子载体内启动子载体; 双顺反子载体双顺反子载体。 在在剪接载体剪接载体中中, 逆病毒的逆病毒的LTR序

12、列和剪接位点保留序列和剪接位点保留, 两两基因共用一个启动子和翻译起始区基因共用一个启动子和翻译起始区; 在在双顺反子载体双顺反子载体中中, 两基因共用一个基因启动子两基因共用一个基因启动子, 但有各自的翻译起始但有各自的翻译起始区区; 在在内启动子载体内启动子载体中中, 两基因各有自己的启动子两基因各有自己的启动子 iii. 自失活载体自失活载体(self-inactivation vector) iv. 自主复制载体自主复制载体(replication-competent vector) 2. 痘病毒克隆载体痘病毒克隆载体 将痘病毒的部分将痘病毒的部分DNA插入细菌载体中插入细菌载体中,

13、借助同源序列借助同源序列的重组作用整合到病毒基因组中的重组作用整合到病毒基因组中U3R U5U3 R U5U3R U5U3 R U5 gag pol env PB(+)SDSA PB(-)RU5U3R gag pol env AAAA 35+RU5U3R env AAAA 35DNAmRNASDSAPIRESIRES-Internal Ribosome Entry SiteApr ori逆病毒的结构和载体结构逆病毒的结构和载体结构3. 昆虫核型多角体病毒载体昆虫核型多角体病毒载体 该类病毒载体是病毒整合型表达载体，具有以下优点：该类病毒载体是病毒整合型表达载体，具有以下优点： 1）外源基因可获

14、得高表达：）外源基因可获得高表达：1-500mg/L 培养物培养物 2）表达产物仍具有生物学活性）表达产物仍具有生物学活性 3）重组效率高）重组效率高BacPAK6Viral DNATransfer VectorTargetgenecDNACotransfectintoinsectcellsIncubate2-3daysHarvestvirusPlatetoobtainindividualplaques(optional)Infectinsectcells(large-scale)AmplifyvirusTiteramplifiedvirus(recommended)Harvestexpess

15、edproteinFigure 2.The BacPAK Baculovirus System.昆虫杆状病毒表达系统昆虫杆状病毒表达系统B Ba ac cP PA AK K6 6 ( (1 13 37 7 k kb b) )O O R RF F1 16 62 29 9O O R RF F6 60 03 3l l a ac cZ ZBsu361Bsu361Bsu361ori2099-bpAcMNPVSV402493-bpAcMNPVM13oripAcUW31 8.5kbPolyA+Pp10PpolyhedrinPolyA+SignalAmprM13ori1433-bpAcMNPVori1250-bpAcMNPVpBacPAK8/95.5kbPpolyhedrinPolyA+SignalAmpr昆虫杆状病毒的昆虫杆状病毒的转移载体和表达载体转移载体和表达载体三三. 标记基因标记基因1. tk基因和基因和dhfr基因基因(胸苷激酶和二氢叶酸还原酶基因胸苷激酶和二氢叶酸还原酶基因) 需相应的突变体需相应的突变体2. gpt基因（来自基因（来自E.coli） 非转化细胞可生长在加有氨基喋呤和霉酚酸，腺嘌呤的非转化细胞可生长在加有氨基喋呤和霉酚酸，腺嘌呤的培养基中。若