Agilent+1260+HPLC+工作原理及色谱柱的使用和保养20140222

1、Agilent 1260 HPLC 工作原理工作原理及色谱柱的使用和保养及色谱柱的使用和保养 2013.5.31Agilent 1260 HPLC 工作原理及简单操作工作原理及简单操作 培训目的： 1.了解HPLC各模块的原理； 2. 掌握HPLC各模块日常维护的要点； 3. 掌握开机，关机。Agilent 1260 HPLC 工作原理及简单操作工作原理及简单操作 内容： 一、 HPLC各模块的原理及维护； 二、开机/关机操作； 一一 、 HPLC各模块工作原理及维护各模块工作原理及维护 HPLC： 高效液相色谱仪（High Performances Liquid Chromatography

2、）。 由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几个部分组成。 工作原理：工作时储液器中的流动相被泵打入系统，样品溶液经样品进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中做相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。关于溶剂关于溶剂HPLC各模块的工作原理及维护所有溶剂应为HPLC级，水应为二次超纯水；所有溶剂应经过过滤。过滤水应使用水相滤膜，过滤有机相应使用有机相滤膜，不能混用。每一次

3、滤膜只能用一次，不能重复使用；如果没有在线脱气机，所有溶剂应经过超声脱气；水易滋生藻类，避免直接照射，过滤水最好使用不要超过两天；如果条件允许可向溶剂中加入0.001-0.0001M的叠氮化钠；注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂；避免使用强酸、强碱或有机氯等腐蚀性溶剂；在溶剂瓶中的溶剂过滤头可能会堵塞，必要时小心拿下用强酸（35%硝酸）浸泡时，用水冲洗，但不要使用超声处理。关于在线真空脱气机关于在线真空脱气机在线真空脱气机的管路容量为12ml，压力范围为110Torr-190Torr。为保证脱气机的良好使用性能，在下述情况下需要用注射器抽洗脱气机管路，每个通道使用不低于30ml的异丙醇。1

4、，新的脱气机或新的管路；2，更换了溶剂，尤其是缓冲盐与有机相之间、两个不相容流动相之间的互换时；3，输液泵关闭了一段时间，或使用挥发性溶剂混合物。HPLC各模块的工作原理及维护关于泵：（四元泵）关于泵：（四元泵）HPLC各模块的工作原理及维护关于泵（泵头组件）关于泵（泵头组件）出口球阀BOV清洗阀Purge Valve柱塞杆Piston主动输入阀AVHPLC各模块的工作原理及维护活塞外框架Seal Wash组件泵头密封垫泵腔更换过滤白头更换过滤白头在清洗阀中的过滤白头需要更换，在清洗状态下，设置流量为5ml/min，此时系统压力如果超过10bar，则需更换过滤白头。更换步骤：1，关闭泵电源；2

5、，用扳手去掉通往进样器上的毛细管，拔掉废液管；3，用专用扳手小心把清洗阀卸下来；4，轻轻去掉聚四氟乙烯密封垫和金密封垫，将过滤白头拿出；5，更换新的过滤白头，装上聚四氟乙烯密封垫和金密封垫；6，装上清洗阀；7，连接管路。过滤白头聚四氟乙烯密封垫金密封垫清洗阀PurgeValveHPLC各模块的工作原理及维护更换过滤白头更换过滤白头1，去掉毛细管，废液管2，卸掉清洗阀3，更换过滤白头4，更换白头，装好清洗阀HPLC各模块的工作原理及维护泵的注意事项泵的注意事项1，溶剂的过滤、脱气；2，避免使用腐蚀性溶剂；3，在满足分析的前提下，尽可能使用较低的流速较低的系统压力。4，更换过滤白头；5，考虑溶剂的

6、相容性；6，尽可能使用新鲜的水；7，使用0.01M以上浓度的缓冲溶液要选配柱塞清洗组件，清洗液不能干涸。8，使用正相溶剂比如环己烷时，建议使用聚乙烯密封垫，部件号为0905-1420，在0200Bar下使用聚乙烯密封垫比标准密封垫更耐磨损。四元泵： 四元泵多通道比例阀MCGV使用时注意，缓冲溶液要放在D通道，以避免盐颗粒析出。建议A通道：水；B、C通道：有机溶剂；D通道：缓冲溶液。HPLC各模块的工作原理及维护样品准备样品完全溶解在流动相中样品没有完全溶解过滤样品，确保样品中不含固体颗粒用流动相或比流动相弱的溶剂溶解样品进样量尽量小关于进样器HPLC各模块的工作原理及维护关于进样器准备位置准备

7、位置调用样品瓶调用样品瓶吸样品吸样品进样和运行位置进样和运行位置标准进样过程标准进样过程 .HPLC各模块的工作原理及维护自动进样器自动进样器样品要干净、经过过滤。样品要干净、经过过滤。l洗针：把样品残留降低到最洗针：把样品残留降低到最小限度，可降低进样的记忆小限度，可降低进样的记忆效应，洗针瓶最好不要加瓶效应，洗针瓶最好不要加瓶垫。垫。l多次吸液多次吸液用于进样量大于用于进样量大于100100l lHPLC各模块的工作原理及维护关于恒温柱箱关于恒温柱箱控制范围：最高80C，低温低于室温10C。预热块体积左面为3ul，右面为6ul，除非有特殊要求，左右温度应保持一致。一定要关闭前面板。HPLC

8、各模块的工作原理及维护检测器检测器DADDAD (Diode Array Detector)二极管阵列检测器，是以光电二极管阵列作为检测元件的UV-VIS检测器.DAD的光源氘灯有一定的半衰期，一般为1000小时左右，所以在没有样品分析任务时要关闭氘灯，以延长氘灯的使用寿命,但是也不要频繁的开关,这样也会影响寿命。同时，打开灯需要预热10min 左右，灯使用时间越长，预热的时间也要越长。流通池污染后，会造成灵敏度下降、噪声加大，应避免脏的样品进入流通池。定期使用异丙醇冲洗系统对保持流通池性能有一定好处。HPLC各模块的工作原理及维护检测器检测器DADHPLC各模块的工作原理及维护检测器检测器F

9、LDHPLC各模块的工作原理及维护FLD(Fluorescence Detector) 荧光检测器：是利用某些溶质在受到紫外光激发后，能发射可见光（荧光）的性质来检测的。FLD是一款具有高度灵敏度和高度选择性的检测器。其激发光源是氙灯，此灯不需要预热。其流通池和DAD的一样，也要定期用异丙醇冲洗，以保证性能。检测器检测器RID示差检测器HPLC各模块的工作原理及维护开机操作：1，打开计算机。2，自上而下打开LC各模块的电源，等待仪器自检完毕，1-2min。3，双击桌面上“Instrument 1 Online”图标，进入化学工作站,在工作站打开各工作模块。4，打开Seal Wash清洗液开关，

10、清洗各管路(510min)。5, 拧上清洗阀，将流量慢慢设为所需流速，平衡30min即可以进样样。关机操作：1，如果使用了缓冲溶液流动相应先用水（510%甲醇）冲洗系统30min。2，用纯有机相冲洗系统30min。3，在工作站上关闭各个模块。4，退出工作站，关闭计算机。5，自下而上关闭LC各个模块的电源。二、二、 开机开机/关机操作关机操作指示灯状态指示灯状态每个部件接通电源后LED灯显示绿色关机 power off准备进样 power on没准备好Not Ready运行Run故障Error驻留ResidentBlink仪器LED状态显示电源开关显示黑Black黑Black黄Yellow绿Gr

11、een红Red黄闪烁Yellow blinking6种LED仪器状态：开机/关机操作逆时针旋转打开清洗阀，清洗阀打开时，液体从废液管中流出，为清洗状态。更换溶剂后，打开清洗阀，设置流量5ml/min，冲洗5-10 min.顺时针旋紧清洗阀为关闭状态,此时流动相由毛细管流向进样器.逆时针打开清洗阀顺时针关闭清洗阀毛细管出口,流向进样器废液管,清洗阀打开时溶剂由此流向废液瓶.开机/关机操作清洗阀清洗阀Purge Valve每次用过仪器后必须做每次用过仪器后必须做! !整台液相色谱仪的维护整台液相色谱仪的维护1. 在使用过含盐缓冲液后必须清水冲洗泵15分钟，此时 必须打开排放阀，不能使废液进入色谱柱

12、。2. 关上排放阀，用90%+10%的水、甲醇溶液冲洗整个系 统，时间为1520分钟，流量1ml/min。本步骤主要是冲 洗干净系统内其他含盐的部位。3. 用纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为 1ml/min。本步骤主要是保护色谱柱。4. 如果未使用缓冲液，上面1、2两步骤可免去，直接用 纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为1ml/min。5.如果较长时间不使用色谱仪，所有管道先用纯水冲洗，再用甲醇冲洗，让所用管路都保存在甲醇中，防止长菌。开/关机操作色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养内容： 一、 正确使用色谱柱； 二、色谱柱的日常清洗和存放。色谱柱的选择色谱柱的选择 非极

13、性或极性较小的样品可用一般的非极性或极性较小的样品可用一般的C18C18柱柱 酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的过的C18C18柱，柱，PHPH范围范围2-92-9（1212） 糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，GPCGPC有有专用柱专用柱 超快速柱子超快速柱子- -填料粒度填料粒度 2 2m m色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养键合相色谱柱键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上作为固定相。这种固定相要占所有柱填料的60-70%优点 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂

14、消除硅羟基的不良影响缺点 pH值不能小于2或大于8 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养反相反相HPLC柱（柱（C18）的性能）的性能常规C18填料的稳定性 硅胶基质填料 pH范围：2-8 pH值大于7时键合相粉碎或溶解 pH值小于2时键合相的化学键断裂 经常用缓冲液 固定相降解填料新的键合技术 - PH范围 2-12 - 稳定性好，使用寿命长1 2 3 4 5 6 7 8 9 pH硅胶的溶解曲线色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养良好的色谱实验习惯良好的色谱实验习惯 拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件 给新色谱柱建立一个档案

15、 定期检测柱效色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养色谱柱的申购色谱柱的申购色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养色谱柱的领用及归还色谱柱的领用及归还 分析室所有色谱柱按照类型进行编号登记造册，建立色谱柱档案，注明采购时间及使用项目名称。 领用新的色谱柱时由使用人按照说明书进行冲洗，按要求测柱效，并做好记录。 分析室所有色谱柱统一放置，取出及归还色谱柱时要做好登记。 试验结束后，使用人要正确冲洗色谱柱，同时记录好与试验、色谱柱相关的信息；不影响自己及其他人的再次使用 如发现色谱柱压力高、峰型差等异常问题，使用人要及时冲洗并按照说明书检测柱效，遇柱效差或分离差的色谱柱附上柱效检测报告，报室主任，同意

16、后报废，统一放置。色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养色谱柱的使用及操作色谱柱的使用及操作 流动相的转换 特别是GPC柱 流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度 专用色谱柱 样品及溶剂的要求记记住住拿拿到到一一根根从从未未用用过过的的色色谱谱柱柱时时 一一定定要要先先看看其其使使用用说说明明！色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养色谱柱的保养（一）色谱柱的保养（一） 样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度 如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养为什么溶剂和样品要过滤为什么溶剂

17、和样品要过滤?溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。由于污染对分析结果的影响。色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。样品过滤头的类型：样品过滤头的

18、类型：30mm 内径：适用于大进样量的过滤，由内径：适用于大进样量的过滤，由0.22m 和和0.45m 两种规格两种规格,材料有纤维素材料有纤维素,醋酸纤维醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于聚四氟乙烯。处理样品体积少于50l。13mm 内径：适用于范围广的过滤，由内径：适用于范围广的过滤，由0.22m 和和0.45m 两种规格两种规格,材材料为纤维素。料为纤维素。3mm 内径：适用于小进样量的过滤，由内径：适用于小进样量的过滤，由0.22m 和和0.45m 两种规格。两种规格。处理样品体积为处理样品体积为7l。色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养色谱柱的保养（二）色谱柱的保养（二） 流动相

19、方面 除去微粒 纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低（建议走空白检验） 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量 注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂 流动相对样品的溶解度 有机溶剂或水的比例色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养溶剂过滤溶剂过滤- -除去微粒除去微粒 不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器以及色谱柱。 遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器和色谱柱的寿命：p使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌。p用滤膜过滤溶剂去除微生物。p每天更换或过滤溶剂。p避免溶剂瓶直接日照。p向溶剂中加入0.0001-0.

20、001M的叠氮化钠。色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养溶剂准备：过滤溶剂准备：过滤色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养选择合适的滤膜选择合适的滤膜 聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜：适用于水基溶剂，不适用于有机溶剂，推荐用于蛋白质和其相关的样品。 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸、70%乙醇、二氯甲烷、不适用于DMF二甲基甲酰胺 再生纤维素滤膜：具有蛋白质吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂。 注意：1）每张滤膜只能用一次。 2）水相和有机相不要搞混。色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养溶剂的相溶性溶剂的相溶性色谱柱的使用和保养

21、色谱柱的使用和保养溶剂信息溶剂信息 避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂：p 卤化物碱金属溶液和相应的酸溶液。p 高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸。p 能够形成卤素自由基或酸的氯化试剂及其混合物。p 含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂。p 在有机溶剂中的有机酸溶液。p 含有强络合剂的溶液。p 四氯化碳和异丙醇或THF混合液。色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养溶剂截止波长溶剂截止波长色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养溶剂准备：脱气溶剂准备：脱气色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养流动相使用前为什么要脱气？流动相使用前为什么要脱气？ 流动相使用前必须进行脱气处理流动相使用前必须进行脱气处理

22、，以除去，以除去其中溶解的气体（如其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭，可能会造成荧光猝灭。色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养典型的流速典型的流速色谱柱的使用和保养色谱柱

23、的使用和保养色谱柱保护色谱柱保护色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养色谱柱常见毛病色谱柱常见毛病 柱压过高 多少才算高? 不同色谱柱有差异 不同系统有差异 不同溶剂有差异 柱效低 重复性差 不出峰，回收率低色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养柱压过高柱压过高 为什么柱压会过高 微粒堵塞 样品 流动相 密封垫 柱床膨胀 不可逆吸附 细菌生长色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养柱效低柱效低 为什么柱效低 色谱柱被污染 过滤片部分堵塞 样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞 色谱柱内的死体积 流动相pH值及组成不合适造成固定相流失 流速急剧变化造成固定相物理损坏 机械震动造成固定相产生裂缝 柱床收

24、缩或干枯色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养重复性差、回收率低重复性差、回收率低 实验的重复性差 色谱柱被污染 流动相pH值及组成不合适造成键合相流失 样品溶剂不同或样品本身不稳定 回收率低，不出峰 “不可逆”吸附 固定相过强或流动相过弱 非特异性吸附色谱柱的使用和保养色谱柱的使用和保养色谱柱的日常清洗色谱柱的日常清洗对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗（如反相C18柱用100%甲醇或乙腈）硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质，再用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化键合相柱(烷基)的一般方法20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗 柱子尺寸 柱子体积 冲洗体积 150 x4.6mm 2.5ml 50ml 200 x4.6mm 3.3ml 65ml 250 x4.6mm 4.2ml 80ml*再有杂质严格清洗： 20倍柱体积的水-相同体积的0.05mol/L硫酸，最后用流动相