分支杆菌培养技术

1、分枝杆菌培养技术培养目的、意义、分类目的： 分离培养临床标本中的分枝杆菌 意义： 诊断结核病金标准 获得菌株鉴定试验纯培养物 获得药敏试验所需的纯培养物 疗效评估分类：简单法:酸性罗氏培养法离心集菌法：中性罗氏培养法、液体培养法（如MGIT960液体培养法）结核分枝杆菌生长要求 专性需氧菌最适生长温度为37最适PH为6.57.2营养要求：氮源、碳源、无机盐（磷、铁、镁、钾、硫等）、生长因子结核分枝杆菌生长特点生长缓慢：在一般培养基上分裂一代需要18-24小时，一般10-30天肉眼可见菌落生长。菌落形态（罗氏培养基）：粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，浅黄色或米色，不透明（ 液

2、体培养基：絮状或颗粒状沉淀。）简单法操作步骤痰标本痰标本2-3ml振荡匀化振荡匀化静置静置15分钟分钟均匀接种均匀接种0.1ml,2支支斜面朝上，放置斜面朝上，放置24小时小时37，培养，培养8周周简单法掌握要点1、原理2、标本类型3、仪器设备4、试剂耗材5、操作注意事项6、结果判读7、质量控制8、讨论一、原理 分枝杆菌因较厚的细胞壁有耐受酸碱的特点，能耐受碱性消化液的处理，消化液直接接种于酸性培养基上，酸性培养基能中和碱性标本处理液，分枝杆菌能在酸性的培养基上生长 2%NaOH 4%NaOH 4%H2SO4注：不同浓度消化处理液对结核菌生长的影响二、标本类型 痰、BF、体液（胸腹水、尿液、C

3、SF等）、大便、组织等 注： 标本是否留取合格 不同标本类型的不同前处理过程 保存方法三、仪器设备1、II级生物安全柜2、恒温培养箱3、漩涡振荡器4、冷冻离心机5、天平6、高压灭菌锅四、试剂耗材1、 4%NaOH2、酸性罗氏培养基成分 味精（谷氨酸钠）（纯度95%以上）7.2g KH2PO4 14 g (中性2.4g) 枸橼酸镁 0.6 g MgSO47H2O 0.24 g 甘油（丙三醇） 12ml 蒸馏水 600ml 新鲜鸡卵液 1000ml 2%孔雀绿 20ml 85 蒸气锅50分钟注：配制培养基需注意的问题、注意识别不合格培养基五、操作注意事项 视痰标本性状，加l2倍体积4氢氧化钠(Na

4、0H)消化液于痰瓶中，涡旋振荡器振荡23分钟，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液后起，整个处理时间不得超过20分钟。样本数较多时，应分批处理。 吸取经前处理后的痰液0.1毫升，无菌操作均匀接种在整个培养基斜面。每份标本接种两支酸性罗氏培养基。接种后，37平卧放置斜面24小时。然后，拧紧培养瓶盖或塞紧试管胶塞，直立放置，37继续培养。六、结果判读及报告分枝杆菌培养阴性： 斜面无菌落生长。分枝杆菌培养阳性(1十)：菌落生长占斜面面积的14。分枝杆菌培养阳性(2十)：菌落生长占斜面面积的12。分枝杆菌培养阳性(3十)：菌落生长占斜面面积的34。分枝杆菌培养阳性(4十)：菌落生长布满全斜面

5、。 分枝杆菌培养阴性应以“(培养阴性)”报告，不能以“()”表示。菌落生长不足以斜面面积14时，实报菌落数。（对可疑培养阳性标本，必须涂片进行抗酸染色确诊）六、结果判读及报告注：培养的第3天，之后每周记一次结果，对可疑的分支杆菌需涂片进行抗酸染色七、质量控制室内质量控制（QC）室间质量评估（EQA）l现场评价 (on-site evaluation)：人力物力，难以日常监控l盲法复检 (blinded-rechecking)：痰标本用完难以重复l批量测试 (panel testing)：在样本准备方面还需要更多的技术投入七、质量控制室内质量控制室内质量控制 人员培训、仪器设备监控、培养基无菌试

6、验、生长试验人员培训、仪器设备监控、培养基无菌试验、生长试验 每月对培养情况培养阳性率、涂阳培阳率和污染率的统计分析每月对培养情况培养阳性率、涂阳培阳率和污染率的统计分析涂阳培阳率涂阳培阳率 公式公式: : 培养阳性的病例总数培养阳性的病例总数 100%100% 涂片检查阳性并进行培养的病例数涂片检查阳性并进行培养的病例数 初诊病人涂阳培阳率应大于初诊病人涂阳培阳率应大于9090污染率污染率 公式公式: : 污染的培养管数量污染的培养管数量 100%100% 培养管总数培养管总数 污染率应小于污染率应小于5%(2-5%)5%(2-5%)。涂阳培阳率过低？涂阳培阳率过低？污染率过高？污染率过高？

7、总结简单法操作流程痰标本中加入痰标本中加入1 12 2倍体倍体积积4 4氢氧化钠氢氧化钠涡旋振荡涡旋振荡30-6030-60秒秒室温静置室温静置1515分钟分钟接种：接种：0.1ml0.1ml，2 2管管37C37C温箱培养水平向上培温箱培养水平向上培养养2424小时小时直立放置直立放置37C37C继续培养继续培养观察报告结果：第观察报告结果：第3 3天、天、7 7天、此后每周一次，直天、此后每周一次，直至满至满8 8周周BACTECTMMGITTM960液体培养技术BACTECTMMGITTM960液体培养技术原理：MGIT960液体培养操作步骤痰标本痰标本2-5ml振荡匀化振荡匀化静置静置

8、15分钟分钟转至离心管，加转至离心管，加PSB至至45ml3000g,离心离心20分钟分钟去上清，加去上清，加1mlPBS，混悬，混悬接种接种0.5ml混悬液混悬液至快培管，上机至快培管，上机试剂耗材1、6%NaOH与等量的2.9%柠檬酸钠混合液2、N-乙酰-L-半胱胺酸（N-acetyl-L-cysteine,NALC） 100ml 6%NaOH-2.9%柠檬酸钠混合液加1gNALC3、 PH6.8PBS4、 BACTEC MGIT Growth Supplement(营养添加剂：葡萄糖、甘油、油酸、触酶、白蛋白、维生素B6 HCl）5、 BBL MGIT PANTA(杂菌抑制剂：阿洛西林、萘啶酸、甲氧苄氨嘧啶、多粘菌素B、两性霉素 B