低分子量硫酸软骨素的制备、抗补体活性构效关系及治疗骨性关节炎的实验研究

1、低分子量硫酸软骨素的制备、 抗补体活性构效关系及治疗骨性关节炎的实验研究研究目的骨性关节炎 (osteoarthritis,OA) 的发病机理非常复杂 , 现在的研 究说明补体系统在0A的发病过程中发挥着重要的作用，而补体系统的替代途径 在0A中又占据主要位置。硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是由D-葡糖醛 酸残基和N-乙酰-D-半乳糖胺残基组成的双糖单位线性连接组成的一类糖胺聚 糖,大量的研究说明其具有缓解、治疗 0A的生物学功能。其中低分子量硫酸软骨素 (1owmolecular weight chondroitinsulfate,LMWCS)在缓解、治疗0A方面

2、效果更加明显。但是1MWCS通过与补体系 统相互作用起到防治0A的作用目前尚未有研究。同时LMWCS由于来源不同、制备工艺不同等导致其具有不同的生物活性,探讨LMWCS与抗补体活性的构效关系，说明LMWCS的结构对补体活性的影响, 将对LMWCS防治0A奠定一定的理论根底,同时对LMWCS的生产具有指导意义。 为了探讨CS抗补体作用与其结构的关系及抗补体作用在其防治0A中发挥的作用,本研究采用4种不同的降解方法对3种不同来源的CS进行降解得到一系歹 LMWCS然后对这些LMWCS的抗补体活性进行评价,研究LMWCS结构与抑制补体 替代途径活性之间的构效关系,并选出一种抗补体活性较高的LMWGS

3、通过对活性较高的LMWC的体内、体外的活性评价，证明其抗补体活性与其 防治0A的关系。最后，针对于目前筛选CS的抗补体活性的方法存在费时、费力 的问题,通过利用近红外光谱分析技术建立一种快速无损的高通量筛选 CS抗补 体活性的方法。研究方法1 LMWCS 的制备及表征本研究拟采用氧化降解法、酶解法、酸降解法以及微波辅助碱降解法对鲨鱼来源、猪来源和牛来源的CS进行降解得到不同的LMWCSs采用傅里叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR) 、高效液相色谱法 (highperformance liquid chromatograph

4、y,HPLC)、紫外可见光谱法、分子排阻色谱-多角度激光散射法 (size exclusion chromatography-multi angle light scattering,SEC-MALLS、)核磁(ruclear magnetic resonance,NMR)等方法对LMWCS的性质进行表征和研究。2不同LMWCS的抗补体活性研究与构效关系分析采用溶血法测定LMWCS抑制替代途径活性的IC50值,通过利用性质的表征结果对 LMWCS的结构和LMWCSs 的抗补体活性之间的构效关系进行研究 ,分析其构效关系 ,进而选择出一种具有 较好的抗补体活性的LMWC用于进一步的体内外活性研究

5、。3LMWC对软骨细胞 的影响体外研究采用酶联免疫分析 (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 的方法研究LMWC对补体替代途径激活过程中补体蛋白 3(complement 3,C3)沉 积的影响；采用补体介导的软骨细胞死亡的方法研究LMWC通过抑制补体活性保护软骨细胞的作用；采用RT-PCR勺方法研究替代途径激活的情况下丄MWCS寸软 骨细胞C3 mRNA水平的影响。4 LMWC对实验性骨性关节炎的影响研究通过采用小鼠内侧半月板不稳定 (destabilization of the medial meniscus,DMM)的方法诱导建立 OA模型。

6、考察LMWC通过口服给药调节补体系统缓解、治疗OA的情况。利用测定小鼠后腿支撑力差值的方法考察小鼠OA的疼痛程度；利用番红固绿染色对LMWC缓解OA的程度进行分析；利用ELISA和免疫组化的方法分别检 测小鼠体内C5b-9的含量水平以及小鼠关节软骨的 C5b-9的含量。5基于近红外光谱分析技术的CS抗补体活性筛选方法的建立收集不同来源、不同相对分子质 量(Mr)的CS样品。采用漫反射的方式采集近红外光谱 , 利用溶血法测定样品抑制替代途径补体 活性的IC50。通过利用因子实验设计的方法优选最正确预处理方法，利用无信息变量消除 (uninformativevariable elimination

7、, UVE),竞争自适应加权采样(competitive adaptive reweighted sampling,CARS) 和随机蛙跳 (rondom frog) 的方法选择有效信息建立偏最小二乘 (partial least square,PLS) 回归模型 , 采 用预测集均方根误差 (root-mean-squares error of prediction,RMSEP)、相对分析误差 (residual predictive deviation,RPD) 等参数对模型的预测能力进行 评价。研究结果1 LMWCS 的制备及表征采取氧化降解法、酶解法、酸降解法以及 微波辅助碱降解法对鲨

8、鱼来源、猪来源和牛来源的CS进行降解共获得12种LMWCSsFTIR结果显示LMWCS和 CS的骨架结构一致；采用HPLC进行双糖分析, 结果说明不同来源的双糖组成不同，同种来源的CS和LMWC组成相同，不同的降 解方法对硫酸根的损失不同 ,酸降解和微波辅助碱降解的硫酸根丧失严重 ,氧化 降解和酶降解对硫酸根含量影响不大；采用紫外分析说明酶解法产生的 LMWCSs 含有不饱和糖醛酸结构；NMR吉果说明酶降解法的LMWCS的非复原端产生了不 饱和糖醛酸,而其它LMWCS的非复原端结构与未降解的CS一致；分子排阻色谱- 多角度激光散射测定LMWCS的重均相对分子质量(厨w)的结果说明,通过利用不

9、同的方法制备了厨 w在1217 Da到8085 Da的LMWCSs.不同LMWCS的抗补体活 性研究与构效关系对LMWCS的结构和活性之间的关系进行研究。结果说明,利用鲨鱼来源的CS采用氧化降解的方法制备的LMWCS(LMWCS-S-O) 具有更好的抗补体活性。对于 LMWCS与抗补体活性进行构效分析说明：Di-2,6diS, Di-4,6diS 和厶Di-6S双糖结构有利于提高 LMWC的抗补体活性, 而厶Di-6S和厶Di-OS不利于提高抗补体活性。LMWCS-S-在缓解、治疗0A中可能具有更好的疗效。并且选择出具有较好 活性的LMWCS-S-和较低活性的猪来源CS(CS-P)进行进一步的

10、活性研究。3 LMWC对软骨细胞的影响采用 ELISA的方法研究LMWC对补体替代途径激活过程中C3沉积的结果说明丄MWCS-S-Ot 400卩g/mL时可以显著性地抑制 C3b的产生，从而抑制替代途径激活。而猪来源CS(CS-P)在 1.2mg/mL时才显著性 的抑制替代途径；对提取的软骨细胞进行形态学和阿利新蓝染色结果说明软骨细 胞提取正确；MT攻验说明在500卩g/mL的浓度下丄MWCS-S-(和CS-P对软骨细 胞并没有毒性；补体介导的软骨细胞死亡的实验结果说明400卩g/mL的LMWCS-S-可以显著性地抑制补体活性保护软骨细胞；RT-PCR勺结果表明丄MWCS-S-OT以显著性地抑

11、制由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的软骨细胞C3mRN水平,从而抑制软骨细胞的C3表达水平。4 LMWC对实验性骨性关节炎的影响通过利用 DMM勺方法成功的建立了小鼠 OA模型；小鼠支撑力结果说明LMWCS-S-可以显著性地缓解OA带来的疼痛。番 红固绿染色结果说明LMWCS-S-可以减少小鼠骨关节外表软骨的损失，缓解OA 的进程；ELISA和免疫组化的结果说明LMWCS-S-可以抑制C5b-9的水平,其可 以通过调节补体活性实现缓解、治疗 OA的作用。CS-P同样表现出了缓解OA的效果，但作用不显著。5基于近红外光谱分析技 术的硫酸软骨素抗补体活性快速筛选方法的建立通过漫反射方式采集了 60个不同来源、不同MM CS样品的光谱,并利用溶血法测定其一级数据(IC50);禾1用 因子设计实验选择了一阶导数-SNV-SG亚滑-MC的最正确预处理方法；利用CARS 法选择了 47个变量建立PLS模型；模型的校正集的相关系数 Rc=0.983,验证集 的相关系数Rp=0.969,验证集的RMSEP=0.376ng,RPD=5.46建立的模型可以用于 CS的抗补体活性筛选。结论和意义通过本研究制备了一系列的 LMWCS研究了 LMWCS与抗补体活 性之间