园艺植物科学研究导论5园艺植物制片方法ppt课件

1、 第五章第五章 园艺植物制片方法园艺植物制片方法 植物制片是进展园艺植物科学研讨所需用的一种根本植物制片是进展园艺植物科学研讨所需用的一种根本方法，比如进展植物各个器官的解剖构造察看、花芽分方法，比如进展植物各个器官的解剖构造察看、花芽分化研讨、授粉受精察看、贮藏营养观测以及染色体察看化研讨、授粉受精察看、贮藏营养观测以及染色体察看等都需求进展制片。经过对切片结果的分析，可以比较等都需求进展制片。经过对切片结果的分析，可以比较不同实验处置的效果以及了解不同树种和种类相应的生不同实验处置的效果以及了解不同树种和种类相应的生物学特性等。植物制片技术是一个相对独立的体系，内物学特性等。植物制片技术是

2、一个相对独立的体系，内容繁多。在本章内容中，将引见在园艺植物科学研讨中容繁多。在本章内容中，将引见在园艺植物科学研讨中常用的一些根本方法和原理。常用的一些根本方法和原理。 第一节第一节 徒手制片徒手制片 一、徒手制片切片及特点一、徒手制片切片及特点 徒手制片普通指徒手用刀片把新颖的植物资料切成薄片的制片方法。徒手制片普通指徒手用刀片把新颖的植物资料切成薄片的制片方法。 此制片法主要优点是：此制片法主要优点是：1能及时察看研讨植物生活组织的构造和天然颜能及时察看研讨植物生活组织的构造和天然颜色；色；2方法及器具简单，不需切片机等机械设备，短时间即可完成。主要方法及器具简单，不需切片机等机械设备，

3、短时间即可完成。主要缺陷是缺陷是1对于微小、柔软、水分过多以及巩固的资料，难以用徒手切成薄对于微小、柔软、水分过多以及巩固的资料，难以用徒手切成薄片；片；2对于操作不熟练者，往往切成厚薄不匀或不完好的切片。对于操作不熟练者，往往切成厚薄不匀或不完好的切片。二、徒手制片的方法及本卷须知二、徒手制片的方法及本卷须知 徒手制片最主要的工具就是刀片，常可用单徒手制片最主要的工具就是刀片，常可用单面保安刀片。要获得良好的切片，首先要坚持刀面保安刀片。要获得良好的切片，首先要坚持刀口的锋利。切片方法及步骤为：口的锋利。切片方法及步骤为： 1 1预备任务盛好清水的培育皿、显微镜、预备任务盛好清水的培育皿、显

4、微镜、载玻片、盖玻片、刀片等器具。载玻片、盖玻片、刀片等器具。 2 2拿取资料进展切片，资料可以是新颖拿取资料进展切片，资料可以是新颖的资料，也可以是经过固定的资料切片时，将的资料，也可以是经过固定的资料切片时，将欲切资料断面和刀片上滴上清水以坚持资料潮欲切资料断面和刀片上滴上清水以坚持资料潮湿。湿。 3以左手拇指、食指、中指捏住资料，拇指应低于食指，以免切伤手指；资料高出指尖。 4右手执刀，将刀平放在食指上，刀口朝内，刀面与资料断面平行，然后以均匀快捷的动作自左前方向右后方以臂力带动刀片程度切割挪动，不要用腕力。同时还要留意，切时动作要迅速，资料一次切下，切忌停顿或拉锯式切割。 5 5延续切

5、数片后，将切下的薄片悄然移入盛水的培延续切数片后，将切下的薄片悄然移入盛水的培育皿中备用。然后挑选薄而透明的切片，放在载玻片上育皿中备用。然后挑选薄而透明的切片，放在载玻片上的水滴中，加上盖玻片制成暂时制片进展察看。的水滴中，加上盖玻片制成暂时制片进展察看。 在实验中，有时因各种情况所取资料无法马上进展在实验中，有时因各种情况所取资料无法马上进展制片。可以将其保管在固定液中，常用的固定液为制片。可以将其保管在固定液中，常用的固定液为F.A.AF.A.A固定液，它不但是优良的固定液也是优良的保管固定液，它不但是优良的固定液也是优良的保管液液 ，其配方为：，其配方为：5ml5ml福尔马林甲醛：福尔

6、马林甲醛：5ml5ml冰醋酸：冰醋酸：50-70%50-70%的乙醇的乙醇90ml90ml。 用徒手切片的资料不宜过大，普通以外表不超越5-8mm 为宜。对于过于柔软或微小的资料如叶片、细小的根尖等需求借助一些夹持物方可进展切片，假设暂时制片需保管一段时间，1将资料封在水中，每隔20-30分钟再加一滴水，此法可坚持数小时；2用10%-30%的甘油水溶液替代清水封片，并将制片放在铺有湿滤纸的大培育皿中保管，或用石蜡或指甲油封边保管，可保管1-2周或更长时间。 第二节第二节 压片及涂片压片及涂片 涂片和压片是进展植物染色体察看研涂片和压片是进展植物染色体察看研讨常用的制片方法。讨常用的制片方法。

7、涂片是将新颖的资料或者是经过固定涂片是将新颖的资料或者是经过固定的资料于载片上，托涂成均匀一层，经染色后的资料于载片上，托涂成均匀一层，经染色后盖上盖玻片镜检。盖上盖玻片镜检。 压片是将处置后的资料于载片上分散压片是将处置后的资料于载片上分散后加盖片，用拇指或镊子悄然挤压盖片，使组后加盖片，用拇指或镊子悄然挤压盖片，使组织分散成一片，然后镜检。织分散成一片，然后镜检。 进展染色体察看时留意，假设进展染色体数目测定要求取样个体数在5个以上，细胞总数在30个以上；假设进展染色体核型分析组型分析)那么要求取样应是来源于不同个体的5个细胞。 一、常规压片法 1.取材：于细胞分裂旺盛时期取样。普通取根尖

8、、茎尖。 2.预处置：防止纺锤体的构成，使细胞分裂停顿在中期阶段；使染色体收缩变短，便于察看统计。常用药剂有秋水仙碱溶液、8-羟基喹啉、对二氯苯饱和水溶液、富民隆。预处置的时间普通为2-12小时。 3. 固定：把细胞迅速杀死，使蛋白量变性沉淀，尽量坚持资料构造的原有形状，以备进一步处置。 常用的固定液为卡诺固定液，即3：1的纯酒精:冰醋酸溶液。固定时间普通为1-24小时。 4.解离：根尖、茎尖等体细胞组织，需经过某些处置，除去细胞之间的果胶层并使细胞软化，这种细胞分别和软化后的组织才便于压片。最常用的是酸水解和酶处置两种。染色：常可用孚尔根染色法或醋酸洋红等核染色染色：常可用孚尔根染色法或醋酸

9、洋红等核染色剂进展染色。剂进展染色。压片：将资料移至载玻片上，盖上盖玻片，用解压片：将资料移至载玻片上，盖上盖玻片，用解剖针或用铅笔的橡皮头在盖玻片上悄然敲击，使细胞剖针或用铅笔的橡皮头在盖玻片上悄然敲击，使细胞分散，再用拇指轻挤压盖片使组织成为一薄层。分散，再用拇指轻挤压盖片使组织成为一薄层。镜检：将压片置于显微镜下察看，选择染色体分镜检：将压片置于显微镜下察看，选择染色体分散、明晰的细胞进展统计记数，并可照相绘图，以便散、明晰的细胞进展统计记数，并可照相绘图，以便进展核型分析。同时可用记号笔在载玻片和盖玻片上进展核型分析。同时可用记号笔在载玻片和盖玻片上分别做记号，以便再次察看和照相。分别

10、做记号，以便再次察看和照相。封固：好的压片，可采用冷冻枯燥后，用光学树胶封固保管。也可进展脱水透明等步骤制成永久切片。假设暂时保管，可以用石蜡封边，放于培育皿中于冰箱冷冻室内短期保管。 二、去壁低渗法涂片法1.取材：同上述常规压片法。2.预处置前处置：同上述常规压片法。3.前低渗：将处置后的资料防灾0.075M KCl低渗液中，在20-25条件下处置30分钟左右.具具B B染色体的黑麦基因组核型染色体的黑麦基因组核型4去壁：倒去KCl溶液，参与2.5%混合酶液纤维素酶与果胶酶各占2.5%，在温度25-30下处置2-5小时左右。酶液与资料的比例适当，酶液不能过少。5. 后低渗：倒去酶液，用蒸馏水

11、冲洗2-3次，然后在蒸馏水中停留5-10分钟左右后进展后低渗。6. 固定：用甲醇:冰醋酸3:1固定液固定。7. 涂片：将去壁固定的资料放在载玻片上，加一滴固定液，然后用镊子将资料夹碎，去掉大块残渣，然后从载玻片一侧向资料悄然吹气，使组织分散成一薄层。8. 火焰枯燥：将载片于酒精灯上悄然加热烤干。9染色：用40:1的Giemsa染液染色4-30分钟或更长，蒸馏水清洗，空气枯燥后可用树胶封片。10. 镜检：于显微镜下察看。 第三节 石蜡制片 石蜡切片是光学显微镜的制片技术中最常用的一种方法，属于永久制片。普通的植物资料都可以用此法制片。但有制造时间较长，操作过程复杂以及资料易发硬或发脆等缺陷。 操

12、作程序如下：操作程序如下： 1. 资料的采集与分割：根据制片的目的和要求采集资料的采集与分割：根据制片的目的和要求采集资料，资料要有代表性。资料采后应尽快进展分割资料，资料要有代表性。资料采后应尽快进展分割固定。为使固定液能迅速的浸透资料，要进展资料固定。为使固定液能迅速的浸透资料，要进展资料分割。分割块宜小不宜大，普通不超越分割。分割块宜小不宜大，普通不超越1cm3，分割，分割后立刻杀死固定。后立刻杀死固定。2. 杀死与固定：利用药剂迅速把细胞杀死，以坚持杀死与固定：利用药剂迅速把细胞杀死，以坚持资料本来的形状和构造。常用的固定液有资料本来的形状和构造。常用的固定液有F.A.A固定固定液、卡

13、诺固定液等，前者还可作保管液。液、卡诺固定液等，前者还可作保管液。 3.3.脱水：除去组织中的水分，便于透明、浸蜡、包脱水：除去组织中的水分，便于透明、浸蜡、包埋等步骤的进展。常用的脱水剂为酒精。脱水采用埋等步骤的进展。常用的脱水剂为酒精。脱水采用等级脱水系列脱水，即从较低浓度酒精开场，等级脱水系列脱水，即从较低浓度酒精开场，逐渐交换到高浓度酒精。逐渐交换到高浓度酒精。4.4.透明：将脱水剂从资料中除去，使资料透明，添透明：将脱水剂从资料中除去，使资料透明，添加折光系数；便于下步的浸蜡和包埋等程序。透明加折光系数；便于下步的浸蜡和包埋等程序。透明剂是一种既能与脱水剂混合，又能与包埋剂混合的剂是

14、一种既能与脱水剂混合，又能与包埋剂混合的药剂。常用的透明剂为二甲苯和氯仿，适用原那么药剂。常用的透明剂为二甲苯和氯仿，适用原那么也是逐级进展，可减少资料收缩。也是逐级进展，可减少资料收缩。 5.5.浸蜡：逐渐除去透明剂浸蜡：逐渐除去透明剂, ,并为包埋剂所替代。常并为包埋剂所替代。常用的包埋剂是石蜡。浸蜡过程是使石蜡渐渐溶于浸用的包埋剂是石蜡。浸蜡过程是使石蜡渐渐溶于浸有资料的透明剂中，溶解在透明剂中的石蜡渐渐深有资料的透明剂中，溶解在透明剂中的石蜡渐渐深化到资料的细胞中去，最后使透明剂完全被石蜡取化到资料的细胞中去，最后使透明剂完全被石蜡取代，以便切片。代，以便切片。6.6.包埋：将浸蜡后的

15、资料包埋在石蜡中。此步骤要包埋：将浸蜡后的资料包埋在石蜡中。此步骤要迅速，且不要使石蜡块中有气泡。留意将样品编号迅速，且不要使石蜡块中有气泡。留意将样品编号封于蜡块上，以免样品混淆，以备切片。封于蜡块上，以免样品混淆，以备切片。7.7.修块和切片：将已包埋好的蜡块切成小块，每一小块修块和切片：将已包埋好的蜡块切成小块，每一小块包含一块资料。然后按照所需的切面，进展修整。把蜡包含一块资料。然后按照所需的切面，进展修整。把蜡块粘接在载蜡器上，用切片机将蜡块切成延续的蜡带。块粘接在载蜡器上，用切片机将蜡块切成延续的蜡带。8.8.粘片：将切下来的切片粘在干净的载玻片上。粘片时粘片：将切下来的切片粘在干

16、净的载玻片上。粘片时先在载玻片上滴上一小滴粘片剂，加几滴蒸馏水，然后先在载玻片上滴上一小滴粘片剂，加几滴蒸馏水，然后用镊子小心把切片放在水上，在用镊子小心把切片放在水上，在35-4035-40下，用拨针将下，用拨针将切片伸直、展平，倾斜载片，使水流去并烘干。切片伸直、展平，倾斜载片，使水流去并烘干。9.9.脱蜡、染色、脱水透明和封片：粘片后要经过脱蜡、脱蜡、染色、脱水透明和封片：粘片后要经过脱蜡、染色、再次脱水透明，然后封片永久保管。染色、再次脱水透明，然后封片永久保管。 脱蜡、染色和脱水透明的过程仍采用等级法逐渐进展。最后加拿大树胶封片，然后贴标签镜检及保管。 以上是石蜡制片的普通步骤；为了

17、获得良好的制片效果，需求制片者的大量实际并在实际中不断探求、积累阅历方可。亮叶忍冬叶片解剖构造亮叶忍冬叶片解剖构造韭菜根横切面韭菜根横切面女贞茎横切女贞茎横切面皮孔面皮孔南瓜茎横切面部分南瓜茎横切面部分第四节第四节 电镜制片电镜制片 电子显微镜简称电镜大体上分两类，一是扫描电镜，二是透射电镜。扫描电镜能直接察看到样品外表的三维立体构造，如植物的花、叶、果实的外表构造等；投射电镜可察看到植物组织的超微构造，如叶绿体的膜构造韧皮部引导组织构造等等。它们的制片方法有很大不同。一、扫描电镜常规制片方法一、扫描电镜常规制片方法一取材一取材 根本要求是根本要求是 ：动作应迅速、部位要准确：动作应迅速、部位

18、要准确 ；刀片；刀片要锋利；尺寸不宜过大要锋利；尺寸不宜过大 ；采取易分散的资料，要留；采取易分散的资料，要留意防尘、样品分散；数量必需取够。意防尘、样品分散；数量必需取够。 二二 清洗清洗 共清洗共清洗3 3次。次。 清洗掉样品外表杂质等附着物；清洗掉样品外表杂质等附着物； 除掉没有和样品成分发生反响的固定剂。常用的清洗除掉没有和样品成分发生反响的固定剂。常用的清洗液有蒸馏水、生理盐水、各种缓冲液以及含酶的清洗液有蒸馏水、生理盐水、各种缓冲液以及含酶的清洗液，可依详细情况选择液，可依详细情况选择 。三固定三固定 目的是目的是 尽量完善的稳定和保管样品细胞内的各种成分和构造，使尽量完善的稳定和

19、保管样品细胞内的各种成分和构造，使其接近生活时的形状。其接近生活时的形状。 常用的方法是戊二醛常用的方法是戊二醛四氧化锇双固定法。先四氧化锇双固定法。先用用1-3%1-3%的戊二醛的戊二醛/ /缓冲液固定数分钟至数小时，再用缓冲液固定数分钟至数小时，再用1%1%锇酸锇酸/ /缓冲液在缓冲液在44下固定下固定30-60min30-60min。 四脱水和置换四脱水和置换 采用系列乙醇或丙酮逐级脱水，普通为：采用系列乙醇或丙酮逐级脱水，普通为： 30%50%70%80%95%100% 30%50%70%80%95%100%，每步，每步15-20min15-20min。 五枯燥五枯燥 是制片关键一步。

20、目的是去除样品中的游离水或已取代游离水的是制片关键一步。目的是去除样品中的游离水或已取代游离水的脱水剂，使样品中不含有液态物质脱水剂，使样品中不含有液态物质 。临界点枯燥法是目前公认的较好。临界点枯燥法是目前公认的较好方法。方法。 六粘样六粘样 将枯燥好的样品用导电胶将样品粘在样品台上，并做将枯燥好的样品用导电胶将样品粘在样品台上，并做好标志。常用的有银粉导电胶、石墨粉导电胶、双面胶带、好标志。常用的有银粉导电胶、石墨粉导电胶、双面胶带、普通胶水等。普通胶水等。七镀膜喷涂七镀膜喷涂 是把粘贴到样品台上的样品和样品台外表同时喷涂上是把粘贴到样品台上的样品和样品台外表同时喷涂上一层金属膜，使样品具

21、有良好的导电性，以便下一步察看。一层金属膜，使样品具有良好的导电性，以便下一步察看。普通喷涂普通喷涂10-20nm10-20nm厚的金属膜，常用的金属有金、铜、铝、厚的金属膜，常用的金属有金、铜、铝、金金- -钯。钯。八察看八察看 喷好的样品就可以用扫描电镜进展察看了喷好的样品就可以用扫描电镜进展察看了普通普通20kv20kv。假设一时不能察看，需把样品。假设一时不能察看，需把样品放入枯燥器中保管，以防受潮或被污染。放入枯燥器中保管，以防受潮或被污染。OK！扫描电子显微镜扫描电子显微镜苹果花粉粒苹果花粉粒蜀葵花粉粒蜀葵花粉粒一串红花粉粒一串红花粉粒二、透射电镜制片根本方法超薄切片二、透射电镜制

22、片根本方法超薄切片一取样一取样 要求取样要有代表性、迅速、准确、及时、体积小、要求取样要有代表性、迅速、准确、及时、体积小、低温、防损伤。普通要求体积低温、防损伤。普通要求体积0.5-1.0mm20.5-1.0mm2。二固定二固定 目的是要在分子程度上真实的保管细胞超微构造的目的是要在分子程度上真实的保管细胞超微构造的每一细节。常用的方法是化学固定法，目前大部分植物每一细节。常用的方法是化学固定法，目前大部分植物资料采用的固定方法是戊二醛资料采用的固定方法是戊二醛锇酸双固定法，即先用锇酸双固定法，即先用戊二醛作预固定，然后用锇酸作后固定。对于普通植物戊二醛作预固定，然后用锇酸作后固定。对于普通

23、植物叶、幼茎、幼根可用叶、幼茎、幼根可用3%3%的戊二醛固定的戊二醛固定2 2小时，用小时，用1-2%1-2%四四氧化锇固定氧化锇固定2-32-3小时。小时。 三脱水三脱水 常用的脱水方法是逐级脱水，即采用的脱水剂浓度梯常用的脱水方法是逐级脱水，即采用的脱水剂浓度梯度为度为30%50%70%80%90%95%100%30%50%70%80%90%95%100%100% 100% 浓度浓度中换中换3 3次，常用的脱水剂为乙醇或丙酮。每一级脱水剂次，常用的脱水剂为乙醇或丙酮。每一级脱水剂中停留时间为中停留时间为10-20min10-20min，脱水剂用量普通为样品体积的，脱水剂用量普通为样品体积的

24、1010倍以上。倍以上。四浸透与包埋四浸透与包埋 将脱完水的组织先后经过脱水剂和环氧树脂浸透液将脱完水的组织先后经过脱水剂和环氧树脂浸透液是常用的包埋剂，目前常用的型号为是常用的包埋剂，目前常用的型号为Epon812Epon812，比例，比例分别为分别为3 3：1111：1111：3 3，每步，每步30-60min30-60min。将浸透好的。将浸透好的样品块放到适当模具中，灌上包埋液包埋，经过加温聚样品块放到适当模具中，灌上包埋液包埋，经过加温聚合构成一种固体基质也叫包埋块，已备切片。合构成一种固体基质也叫包埋块，已备切片。六超薄切片六超薄切片 规范的超薄切片应该是厚度适中、均匀、平整、无刀

25、痕、规范的超薄切片应该是厚度适中、均匀、平整、无刀痕、无颤纹和皱褶。根本步骤为：预备切片刀和铜网无颤纹和皱褶。根本步骤为：预备切片刀和铜网修整包修整包埋块埋块切片切片捞片。捞片。 铜网预备：超薄切片要放在载网上才干进展染色等操作，铜网预备：超薄切片要放在载网上才干进展染色等操作，并最终放到电镜中察看。载网是用无磁性金属资料做成的，并最终放到电镜中察看。载网是用无磁性金属资料做成的，厚厚5050微米，直径普通为微米，直径普通为3mm3mm，普通用铜资料，所以又叫铜网。，普通用铜资料，所以又叫铜网。铜网要经过清洗，方可运用。目前清洗方法主要有：超声铜网要经过清洗，方可运用。目前清洗方法主要有：超声波清洗法、酸碱清洗法。波清洗法、酸碱清洗法。 支持膜的预备：铜网的网孔很小，但对于放置超薄切片支持膜的预备：铜网的网孔很小，但对于放置超薄切片及其他样品来说，网孔还嫌大，缺乏以平坦地支持切片，及其他样品来说，网孔还嫌大，缺乏以平坦地支持切片，所以要在铜网上覆一层透明的膜所以要在铜网上覆一层透明的膜支持膜。支持膜。 切片刀预备：超薄切片刀有两种，一是金刚刀，二是玻璃刀。前者价钱昂切片刀预备：超薄切片刀有两种，一是金刚刀，二是玻璃刀。前者价钱昂贵、质地巩固、经久耐用；后者制造方便、价钱低廉、但刀刃较脆、不耐用、贵、质地巩固、经久耐用；后者制造方便、价钱低廉、但刀刃较脆、不耐用、不能切硬质资