植物灰分和各种营养元素的测定教学ppt课件

1、第十三章 植物灰分和各种营养元素的测定: yangcHgnjA概述v灰化的目的v总灰分 v样品经高温灼烧，有机物中的碳、氢、氧等物质与氧结合成二氧化碳和水蒸汽而碳化，残留物呈无色或灰白色的氧化物 。v粗灰分 v熄灭时生成的炭粒不易完全烧尽，样品上能够粘附有少量的尘土或加工时混入的泥沙等，而且样品灼烧后无机盐组成有所改动，如：碳酸盐添加，氯化物和硝酸盐的挥发损失，有机磷、硫转变为磷酸盐和硫酸盐，质量均有改动。所以实践测定的总灰分只能是“粗灰分 。v灰分元素v磷、钾、钙、镁、钠和多种微量元素 。v二、灰化的方法普通灰化法；灰化后的残灰用水浸湿后再次灰化；灰化后的残灰用热水溶解过滤后再次灰

2、化残渣；添加醋酸镁或硝酸镁或碳酸钙等灰化；添加硫酸灰化 。各种试样灰化的条件试样名称 测定条件* 试样量(g) 谷物及其制品 (燕麦、大麦、小麦、玉米、 荞麦、稻米、小麦粉及谷物粉类、谷物的副产品) B (1) B (5) 约550 700 35 谷物及其制品 (糙米、大米、大麦仁、裸麦、麦仁、小麦、小麦仁) (麸皮、细麸皮、大豆粉、淀粉) B (5) B (1) 600 600 5 3 风干植物茎叶等 新鲜或含水多植物茎叶等 淀粉、淀粉制品、甜食等 水果及其制品 蔬菜及其制品 咖啡及其炒豆、茶叶、坚果及其制品 牛乳、奶油、浓缩乳 油脂 (1) A (1) B (1) AB(1)(2)(3)

3、AB(1)(2)(3) B(1)(2)(3) AB (1) C (1) 525 525 约525 525 约525 约525 550 550600 23 1020 510 25 510 510 45 50 糖密、砂糖及其制品 蜂密 肉及肉制品，肉的提取物 鱼类及其海产品 B(1)(2)(3) AB(1) B(1)(2)(3) (1)(2)(3) 525 600 约525 550 35 510 35 2 柠檬、桔子提取物和香精、香草提取物 AB(1)(2)(3) 约525 10mL 原糖、砂糖、粗糖密、白糖 B (4) 800 35 *此表摘自日本食品工业学会编，郑州粮食学院译， 食品分析法1四

4、川科技出版社，1986，稍有改动。 三、植物营养元素待测液的制备方法灰化法 灰化后用稀酸溶解酸溶法硫酸-双氧水；硫酸-高氯酸；硫酸-高氯酸-氢氟酸；硝酸-高氯酸-盐酸；盐酸或硝酸浸提。碱溶法碳酸钠、氢氧化钠或偏硼酸锂熔融绿色环保消化技术微波消解微波是一种高频电磁波，其频率为3 x 102一3 x 105MHz，波长从0.01mm到1m，包括分米波、厘米波、毫米波和亚毫米波，在电磁波谱系列中，其高频端与远红外线相邻，而低频端与普通无线电波的超短波衔接。微波热效应原理：物质的离子、极性分子及因电场作用而产生的极化分子在迅速交变的微波场中交替陈列，高速振荡、摩擦和碰撞而瞬间产生的。微波在化学领域中的

5、运用微波能有助于物质的合成和分解试样；微波能测定水分；试样水分的测定，普通采用微波热效应烘干法，或试样介电常数丈量法。此外还有用双方式微波传感器丈量由于资料含水率不同而引起的两种方式谐振频率之差以测定水份。微波促进气固反响。美国Dow化学工业公司等报道了一种用炭吸附NOx后用微波处置使其复原成无害的氮气和二氧化碳的方法。张达欣等采用易吸收微波的活性炭为吸附剂和复原剂，不需任何催化剂，用3/4人同轴腔为反响器，微波辐射，将氮氧化物复原分解为无公害的N2和CO2气体。微波消解的优点1.速度快:消解可经过提高温度/压力协助反响，使反响物在特定温度下发生快速分解，比普通消化快4-100倍完成。2.不改

6、动反响方向：2450MHz微波只导致分子运动，不引起分子构造变化，大多数传统试剂不会由于其活性成分的蒸发而降低或失去强度，从而不会改动消解反响的方向。3.效率高：微波直接向样品释放能量，防止传统方式中能量的损失，提高了能量的运用效率。4.准确：经过磁控管可控制分解条件，防止了人为操作产生的错误和误差。经过温压控制可以保证消解的质量，保证反响一致的平行性和反复性。5. 防止过氯酸的运用：如HNO3在微波消化期间，基于消化瓶内压力的缘故，会产生较高的温度，可取代过氯酸的运用。6. 防止元素的挥发元素、污染和毒害：如：As，Hg等可被保管在消化溶液中，降低的空白值，操作人员防止接触酸雾和有害的气体，

7、微波消解仪微波消解仪微波消解罐微波消解酸选择的普通准那么硝酸：广泛用于酸消解。能氧化侵蚀金属和有机物质。Au，Pt，Nb，Ta和Zr不能被硝酸溶解。Sn，Sb和构成不溶性的水合氧化物。能溶解大多数硫化物，UO2和U3O8。在起始反响后，可参与过氧化氢以使消解彻底。主要用于有机样品如脂肪、饮料、蛋白质、碳水化合物、植物资料、废水、一些颜料和聚合物。盐酸：本身运用不广。用于溶解弱酸的盐，碳酸盐，磷酸盐和无机氧化物、(如Fe2O3)和铝金属重。硫酸：可完全破坏几乎一切的有机物，进展快速脱水炭化。沸点:339，用于有机组织、氢氧化物、合金、金属和矿石。采用玻璃或石英容器可扩展硫酸的适用温度范围。运用于

8、敞口微波消解系统如美国公司的Ta系统采用玻璃或石英容器。HClO4是一种强氧化剂，能与其他酸不反响的金属反响，也能完全分解有机物，然而当热高氯酸与有机物及容易氧化的无机物接触时，能够会产生爆炸，由于高氯酸在微波系统的密闭容器中加热时阅历了一个不可逆的分解反响，产生一种气态最终产物呵斥压力迅速上升，构成潜在的要挟。慎重运用。H3PO4热磷酸胜利的用于那些用盐酸消解时会使某些特定痕量组分挥发损失掉的铁基合金。磷酸除了可消解铁基合金，还可溶解许多铝炉渣、铁矿石、铬及碱金属。BF4四氟硼酸用于那些需求分解硅酸盐和需高温条件的含有无机基体的地质样品的消解。在227的密闭容器中其分压仅为57atm，不需高

9、压就可得到比氢氟酸更高的温度，且酸并不分解。硅酸盐、地质样。HF适用于彻底消解含硅样品。HCl:HNO3(王水)用于无机物如金和铂的消解。植物组织和废水也通常用此混合酸消解。王水能从硅脉石中滤去金属但不能使其全部溶解。HNO3:H2SO4得益于硫酸盐的络合物的构成及高温下脱水和氧化的性质。普通体积比1:1。起始反响后参与过氧化氢可使反响完全，但须当液体体积减少至可看到SO2烟雾时才参与。适用于聚合物、脂肪和有机资料HNO3:HF普通体积比为HNO3:HF=1:5，溶解Ti，Nb和Zr(除ZrO2)。合金、碳化物、氮化物、硼化物、硅酸盐岩石、灰、矿渣和高硅含量的植物资料可用此混合酸消解。过氧化氢

10、:假设HNO3消解食物或类似样品后仍有剩余有机物存在，可以参与过氧化氢，但应小心从事。过氧化氢必需在预处置阶段和低功率条件下(250)进展辅助，或在主要有机物质被消解后才干参与。需求炭化的样品须在密闭容器消解操作的后期蒸发掉硝酸和水，然后参与过氧化氢彻底消解有机物质。硝酸和水蒸发到产生浓白的SO2烟雾为止。过氧化氢应逐滴参与，直到溶液变清为止。HNO3:HCl:HF通常方法是制成逆王水(HNO3:H体积比3:1)，然后再和H以7:3的体积比混合。另一种比例为HNO3:H:H体积比为5:15:3。用于消解合金、硅酸盐岩石、灰、矿渣、粘土、玻璃和一些陶瓷。H2SO4:H3PO4比例为1:1用于消解

11、样品运用量原那么有机样品样品：机样品应限制到0.52g物质/容器，取决于样品有机物的含量的高低。如石油属重有机物，平安限不能超对于陌生样品从0.10.2g开场逐渐添加到0.5g，这将防止样品消解过程中过量气体副产物的积累。无机样品量：限制在10g物质/容器。典型的限制要素是消解/萃取品所需酸的量。有机-无机混合样：假设样品中含有5%以上有机物时，需把此样品视为有机物，并根据有机物的处置方式来消化整个样品。温度/压力运用原那么温度不超越250 压力视仪器的质量，普通不超越20atm)典型微波消解操作：硝酸-盐酸消解：称取12干试样置于消解罐中，参与10mL硝酸和5mL盐酸，旋紧罐盖，静置一夜以防

12、加热反响过分猛烈，然后，按以下步骤在微波炉中进展处置：30%全功率4min50%全功率4min100%全功率4min。将样品罐静止冷却至室温，开盖，浓缩至2mL，在25mL容量瓶中用去离子水稀至刻度。硝酸-氢氟酸-双氧水消解：称取干试样12置于消解罐中，参与硝酸10mL和50%HF3mL，静置一夜，然后，在微波炉中按以下步骤处置：30%全功率4min60%全功率4min100%全功率2min40%全功率5min。冷却后，参与30%的H2O210mL，将溶液在微波炉中浓缩后转入25mL容量瓶中，稀至刻度。过滤沉淀后，待测。一植物氮的测定待测液制备方法开氏消化；硫酸-双氧水法测定方法蒸馏法。纳氏比

13、色法。靛酚蓝比色法。碱解分散法康惠皿法氨气敏电极法。甲醛法二植物磷的测定待测液制备方法硫酸-双氧水；硫酸-高氯酸。测定方法钼蓝比色法钼黄比色法三植物钾的测定待测液制备方法硫酸-双氧水；硫酸-高氯酸；灰化法；6M盐酸浸提法。测定方法火焰光度法。四植物钙、镁的测定待测液制备方法硫酸-双氧水；硫酸-高氯酸；灰化法；硝酸-高氯酸-盐酸测定方法AAs法；留意阴离子的干扰ICP法；EDTA络合滴定法。五植物硼的测定待测液制备方法灰化法或碱熔法；测定方法甲亚胺比色法；姜黄素比色法。邻二杂菲镉缔合/硝基苯萃取原子吸收法硼的测定邻二杂菲镉缔合/硝基苯萃取原子吸收法1、方法原理 硼虽可用无火焰-AAS法测定，但在

14、石墨炉中易构成碳化硼难于原子化而降低了其测定的灵敏度。 在硫酸的介质中，用氟化铵将样品消解液中的BO33-转化为BF4-，然后使之与Cd(phen)32+三1,10-含邻二氮菲镉离子缔合，反响如下：以硝基苯萃取，在空气-乙炔火焰中，用AAS法测定镉的含量从而间接测定硼的含量。2、试剂、试剂Cd(phen)32+Cd(phen)32+溶液：取溶液：取2mg/mL Cd2+2mg/mL Cd2+和和5mg/mL5mg/mL邻二氮菲配成邻二氮菲配成100mL100mL溶溶液；液；500mg/L KBF4500mg/L KBF4溶液液和溶液液和1.25mol/L NH4F1.25mol/L NH4F溶

15、液；溶液；1/15mol/LKH2PO4-1/15molNa2HPO41/15mol/LKH2PO4-1/15molNa2HPO4缓冲溶液缓冲溶液(pH=4.9)(pH=4.9)3、操作、操作称植物样称植物样12g至消化杯，加浓硝酸至消化杯，加浓硝酸15mL,高高氯酸氯酸2mL，稳定剂高锰酸钾，稳定剂高锰酸钾0.01g，微波消解，微波消解制成待测液。制成待测液。取适量待测液加取适量待测液加1.25mol/L NH4F溶液和浓硫溶液和浓硫酸各酸各5mL，80加热加热30min，置于分液漏斗，置于分液漏斗中，参与中，参与pH=4.9缓冲液缓冲液10mL，摇，摇1min，加，加Cd(phen)32+

16、溶液溶液0.7mL充分混合，用硝基充分混合，用硝基苯苯5mL萃取萃取3min，取有机相于，取有机相于228.2nm处处AAS测定镉，然后计算硼的含量。测定镉，然后计算硼的含量。3、方法评述可用可用MIBKMIBK、三氯甲烷或乙酰丙酮等作为萃取剂；、三氯甲烷或乙酰丙酮等作为萃取剂；对植物样品消解处置后的常见离子进展实验阐明，因对植物样品消解处置后的常见离子进展实验阐明，因萃取体系控制萃取体系控制pHpH值在值在5.05.0左右，左右，Al3+Al3+、Fe3+Fe3+大部分沉淀大部分沉淀分别；分别；Na+Na+、K+ K+ 、Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+也不能取代也不能取代Cd(phen)

17、32+Cd(phen)32+中的中的CdCd，因此很难进入有机相中；，因此很难进入有机相中；F-F-、C1- C1- 、NO3- NO3- 、ClO4-ClO4-、SO42- SO42- 、C032-C032-、PO43-PO43-等虽有与等虽有与Cd(phen)32+Cd(phen)32+缔合趋势，但在萃取条件下，络离子的空间构型迫使变缔合趋势，但在萃取条件下，络离子的空间构型迫使变形性大形性大, ,不易与不易与Cd(phen)32+Cd(phen)32+缔合，或优先进入有机相，缔合，或优先进入有机相，致使共存离子达不到干扰。致使共存离子达不到干扰。测定有机相中的吸光度，硼的特征浓度为测定有

18、机相中的吸光度，硼的特征浓度为0.0160.016g/mLg/mL1 1，线性范围是，线性范围是0.005-1.20 0.005-1.20 g/mLg/mL。硼的测定荧光法硼荧光分析多在强酸介质或有机介质中进展，且灵硼荧光分析多在强酸介质或有机介质中进展，且灵敏度和选择性不够理想，有的反响时间较长、试剂稳定性敏度和选择性不够理想，有的反响时间较长、试剂稳定性差。差。方法原理：方法原理：在近中性的水介质中，在近中性的水介质中，2-(5-2-(5-甲基甲基-2-2-胂酸基苯胂酸基苯) )偶氮偶氮-1,8-1,8-二羟基二羟基-3,6-3,6-萘二磺酸萘二磺酸( (简称简称5-MAsA-I)5-MA

19、sA-I)与硼构成与硼构成在紫外光区强荧光物质，络合反响时间短在紫外光区强荧光物质，络合反响时间短3 35min5min构成，构成，试剂及络合物稳定时间长、选择性和灵敏度均较好，可直试剂及络合物稳定时间长、选择性和灵敏度均较好，可直接植物样品中微量硼的测定。水定容接植物样品中微量硼的测定。水定容, ,于于ex=235nmex=235nm，em em =367nm=367nm处处, ,测定溶液的荧光强度。测定溶液的荧光强度。在在25mL25mL比色管中依次参与比色管中依次参与0.5mmol/L0.5mmol/L荧光试剂荧光试剂5-MAsA-I,5-MAsA-I,水溶液水溶液 2.0mL 2.0m

20、L ，pH6.7pH6.7的磷酸氢的磷酸氢二钠二钠- -磷酸氢二钾缓冲溶液磷酸氢二钾缓冲溶液5.0mL5.0mL和一定量的规范和一定量的规范硼溶液或样品试液，以二次蒸馏水定容，于硼溶液或样品试液，以二次蒸馏水定容，于ex= 235nm ex= 235nm ，em=367nmem=367nm处处, ,测定溶液的荧光测定溶液的荧光强度。强度。操作步骤测定的要点酸度对荧光强度的影响：在 pH6.7的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾为反响的缓冲介质，络合物在pH6.37.3范围内,荧光强度最大且稳定。缓冲剂用量的影响：缓冲剂用量在37mL范围内,荧光值根本不变。荧光试剂用量：缺乏那么反响不完全, 过大那么荧光猝

21、熄灭，在实验条件下, 在13mL范围内荧光强度根本不变。荧光配合物稳定性：35min完成反响且至少稳定5h。络合物组成比为B R=1 2。线性范围：02ppm。硼的诊断目的甜菜硼的诊断：极度缺硼(B，18 mgkg-1)； 供应中等(B，1830 mgkg-1 )； 供应充足(B，30 mgkg-1) 。甘蓝型油菜的硼诊断： 严重缺硼(B，5 mgkg-1)； 明显缺硼(B，58 mgkg-1 )； 不缺硼(B，10 mgkg-1)。 六植物锰的测定待测液制备方法灰化法；酸溶法。测定方法AAs法或ICP法；高锰酸钾比色法。植物锰的诊断目的燕麦、小麦为15 mgkg-1，大豆为20 mgkg-1

22、，大麦为15 mgkg-1，亚麻、胡萝卜、苜蓿为15 mgkg-1，甜菜为10 mgkg-1，豌豆为8 mgkg-1。留意植物在不同发育时期以及不同部位的差别。七植物铜、锌的测定待测液制备方法：灰化法；酸溶法。测定方法：AAs法或ICP法；诊断目的铜柑桔叶片6 mgkg-1；梨、苹果叶片5 mgkg-1；桃7 mgkg-1。苜蓿全株10 mgkg-1；大豆新成熟叶片为10 mgkg-1；棉花新成熟叶片为8 mgkg-1；玉米开场吐絮时的耳叶为5 mgkg-1；大、小麦叶片为6 mgkg-1；水稻稻草的含铜浓度为6 mgkg-1。 锌锌 少于少于15 mgkg-1，能够发，能够发生缺锌景象；生缺

23、锌景象； 少于少于24 mgkg-1能够对锌能够对锌肥有良好反响。肥有良好反响。 普通作物含锌少于普通作物含锌少于15 mgkg-1时，能够对锌肥有时，能够对锌肥有良好反响良好反响 八植物钼的测定待测液制备方法：灰化法。测定方法：硫氰酸比色法；极谱法；无火焰AAs法或ICP法；二甲氧基经基苯基荧光酮光度法钼的测定二甲氧基羟基苯基荧光酮光度法方法原理： 外表活性剂2,3,7三羟基荧光酮类试剂(如水杨基荧光酮、苯基荧光酮、二溴苯基荧光酮、二溴羟基苯基荧光酮、邻羟基萘基荧光酮等与钼构成配合物，其显色反响灵敏度较高，选择性较好，可用光度法测定钼的含量。 荧光酮试剂二甲氧基羟基苯基荧光酮(DMHPF)，

24、学名是2,3,7-三羟基-9-(3,5-二甲氧基-4-羟基)苯基荧光酮，其构造式为：并利用Mo6+-DMH-PF-Tritonx-100三元体系，构成与钼的显色反响，建立了测定痕量钼的方法。在硫磷混酸(H2SO4酸度0.04l-0.086mol/L)介质中，构成钼/试剂=1：1的红色配合物，最大吸收锋526nm，表观摩尔吸光系数为1.2510mol/L/cm，钼含量在0-8g/25m1范围内符合比耳定律。反响的选择性较其他荧光酮试剂有所改善，特别是三价铁的允许量可高达175mg/mL，而且钒、钨、钴等的允许量也有所提高。方法简便、快速、准确，用于样品中钼的测定获得称心结果。仪器与试剂722型分

25、光光度计硫磷混酸溶液：分别取硫酸24mL，磷酸80mL，用水稀至500m1。 二甲氧基羟基苯基荧光酮DMH-PF溶液：0.4g/L，称取DMHPF 0.0400g，加3mol/L H2SO4 7mL，乙醇20m1搅拌溶解，加少许乙醇稀释移至100mL容量瓶中，用95乙醇定容。50g/L tritonx-100溶液。操作步骤称取适量植物样品，加浓HNO3 10ml浸泡24h后低温消解至猛烈反响终了，再加硝酸-高氯酸混酸(2：1)10-15mL，蒸至近干，用稀NaOH调pH近中性后，定容得待测液。移取一定量待测液(钼8g)于25mL容量瓶中，依次参与硫磷混酸溶液2.0mL，50g/L triton

26、x-100溶液5.0m1，DMH-PF溶液2mL，水定容，以试剂空白为参比，用1cm比色皿，于分光光度计526nm波优点测定吸光度。方法评述 酸度实验用硝酸、盐酸、硫酸和磷酸体系， Mo6+-DMH-PF-Tritonx-100的显色反响均可进展，但单独运用少量磷酸时，试剂空白稳定性欠佳，20min后溶液颜色加深且出现浑浊景象。适宜H+为0.07mol/L。显色时间及配合物的稳定性与DMHPF立刻显色，体系的吸光度即达最大且恒定，至少24h内无明显变化。配合物的组成 ：Mo：DMH-PF1：1。干扰实验当测定误差不超越土5%时，以下离子的允许量(以mg计)为：NO3-(410)，SO42-(2

27、50)，Fe3+(175)，C1-(150)，K+(55)，Na+、NH4+ (50)，Zn2+(45)，Cu2+(30)，柠檬酸(25)，酒石酸(20)，Mn2+ (12)，Mg2+、Ni+(10)、A13+(7)、草酸(05)。植物钼的诊断目的普通为普通为0.1-0.5 mgkg-10.1-0.5 mgkg-1。三叶草顶部三叶草顶部0.5mgkg-10.5mgkg-1；苜蓿苜蓿0.28mgkg-10.28mgkg-1；甜菜甜菜0.05mgkg-10.05mgkg-1；大、小麦为大、小麦为0.03 mgkg-10.03 mgkg-1；甜玉米甜玉米0.09 mgkg-10.09 mgkg-1；

28、棉花棉花0.5mgkg-10.5mgkg-1；烟草烟草0.13 mgkg-10.13 mgkg-1等。等。植株含钼的致毒量，有的高达几百植株含钼的致毒量，有的高达几百mgkg-1mgkg-1也不一定表现中毒，但超越也不一定表现中毒，但超越15 15 mgkg-1mgkg-1，作饲料可使家畜中毒。，作饲料可使家畜中毒。一、一、 荧光分析的根本原理荧光分析的根本原理 当用某一种波长的光照射某种物质时，该物质能在极当用某一种波长的光照射某种物质时，该物质能在极短的时间内发出较照射波长稍长的光，这种光称为荧光。能短的时间内发出较照射波长稍长的光，这种光称为荧光。能发出荧光的物质称为荧光物质，用来照射物

29、质使之发出荧光发出荧光的物质称为荧光物质，用来照射物质使之发出荧光的光称为激发光。的光称为激发光。不同的物质所发出的荧光的波长不同，所需求的激发不同的物质所发出的荧光的波长不同，所需求的激发光的波长也不同，这个特性可用来鉴别物质进展定性分析，光的波长也不同，这个特性可用来鉴别物质进展定性分析，同一物质在一定条件下所发出的荧光的强度与浓度有关，据同一物质在一定条件下所发出的荧光的强度与浓度有关，据此可进展物质的定量分析，这种利用物质的荧光特性进展定此可进展物质的定量分析，这种利用物质的荧光特性进展定性定量分析的方法称为荧光光谱法。性定量分析的方法称为荧光光谱法。所用仪器有荧光计和荧光分光光度计。

30、所用仪器有荧光计和荧光分光光度计。 根据所用激发光及所发生荧光波长的不同，分为：根据所用激发光及所发生荧光波长的不同，分为：X X光荧光、光荧光、紫外光荧光、紫外光荧光、可见光荧光可见光荧光红外光荧光等。红外光荧光等。普通所称荧光及荧光分析是指研讨和利用比较多的普通所称荧光及荧光分析是指研讨和利用比较多的用紫外光作激发光的紫外荧光或可见荧光。用紫外光作激发光的紫外荧光或可见荧光。 (1)荧光的产生 当光进入某种物质后，光的能量能够有一部分或全部被物质分子吸收，这些分子的电子那么从基态跃迁至能级较高的激发态，如第一电子激发态或第二电子激发态。跃迁以后，能量较大的激发态分子经过内转换过程把部分能量

31、转移周围分子， 本人回到第一电子激发态的最低振动能级，如图中V=0级。这些分子能够经过发射出相应光子的方式来释放能量而回到基态的各个不同振动能级，这些光子称为荧光。 (2) (2)荧光光谱法的特点荧光光谱法的特点 a a灵敏度高灵敏度高 与其他分光光度法相比较，荧光分析是与其他分光光度法相比较，荧光分析是从与入射光成直角的方向检测荧光发射光，因此是在暗背从与入射光成直角的方向检测荧光发射光，因此是在暗背景下检测荧光发射。而其他分光光度法是正对入射光方向景下检测荧光发射。而其他分光光度法是正对入射光方向检测样品对入射光的吸收，因此是在亮背景下检测暗线吸检测样品对入射光的吸收，因此是在亮背景下检测

32、暗线吸收光谱。收光谱。因此前者可经过运用亮度更强的激光源的方法大大因此前者可经过运用亮度更强的激光源的方法大大提高灵敏度，而后者那么遭到背景干扰的限制。所以荧光提高灵敏度，而后者那么遭到背景干扰的限制。所以荧光法比其他光度法灵敏度要高法比其他光度法灵敏度要高2323个数量级。个数量级。 b b选择性强选择性强 荧光光谱包括激发光谱和发射光谱，而其他光度法荧光光谱包括激发光谱和发射光谱，而其他光度法只能得到物质的吸收光谱，因以后者当两物质的吸收波长只能得到物质的吸收光谱，因以后者当两物质的吸收波长很接近时那么不易分开。很接近时那么不易分开。而荧光法既能利用物质的吸收光谱也能利用物质的而荧光法既能

33、利用物质的吸收光谱也能利用物质的激发光谱来鉴别物质，因此荧光法有两个光谱的双重选择激发光谱来鉴别物质，因此荧光法有两个光谱的双重选择，有更高的选择性。，有更高的选择性。假设某两种物质的吸收光谱很类似，那么可利用激假设某两种物质的吸收光谱很类似，那么可利用激发光谱区别它们。而两种光谱都很类似的物质的数量较吸发光谱区别它们。而两种光谱都很类似的物质的数量较吸收光谱很类似的数量大大减少。收光谱很类似的数量大大减少。其他光度法仅能提供样品的吸收光谱，而荧光法可提供其他光度法仅能提供样品的吸收光谱，而荧光法可提供包括激发光谱、发射光谱、荧光强度、总荧光量、荧光效率、包括激发光谱、发射光谱、荧光强度、总荧

34、光量、荧光效率、荧光偏振、荧光寿命和斯托克斯位移等许多物理参数，可获得荧光偏振、荧光寿命和斯托克斯位移等许多物理参数，可获得有关分子构造和样品浓度的更多信息，这是其他光度法所不能有关分子构造和样品浓度的更多信息，这是其他光度法所不能比较的。比较的。近年来荧光分析在实际上和运用上都获得了艰苦进展，近年来荧光分析在实际上和运用上都获得了艰苦进展，除在医学、药学和生物学等方面外，在农业、环保和食品加工除在医学、药学和生物学等方面外，在农业、环保和食品加工等方面也都有广泛运用、荧光法已成为超微量分析中不可短少等方面也都有广泛运用、荧光法已成为超微量分析中不可短少的工具。的工具。c c能提供更多的信息能

35、提供更多的信息3 3荧光光谱的根本内容荧光光谱的根本内容a a激发光谱激发光谱 用波长延续变化的单色光照射荧光物质使之发光，用波长延续变化的单色光照射荧光物质使之发光，而后让其产生的荧光经过波长固定的单色器照射到检测器而后让其产生的荧光经过波长固定的单色器照射到检测器上，由检测器检测出荧光强度，得到以激发光波长为横坐上，由检测器检测出荧光强度，得到以激发光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标的光谱图，称为激发光谱。激发标，以荧光强度为纵坐标的光谱图，称为激发光谱。激发光谱中有一个或数个峰值，称为激发峰。光谱中有一个或数个峰值，称为激发峰。激发峰所对应的波长为激发波长，在一定条件下物激发峰所对应的波

36、长为激发波长，在一定条件下物质的激发波长仅与物质分子构造有关，因此激发波长可作质的激发波长仅与物质分子构造有关，因此激发波长可作为对物质定性的根据之一。为对物质定性的根据之一。 未经校正的仪器测得的激发光谱称为表观激发光谱，未经校正的仪器测得的激发光谱称为表观激发光谱，它实践上是样品本身的激发光谱与仪器的光源、单色器、检它实践上是样品本身的激发光谱与仪器的光源、单色器、检测器等光学器件的光谱特性的迭加。测器等光学器件的光谱特性的迭加。由于不同仪器的性能不同，因此不同仪器测得的表观由于不同仪器的性能不同，因此不同仪器测得的表观光谱不能相互比较，必需从中扣除仪器本身的光谱特性，获光谱不能相互比较，

37、必需从中扣除仪器本身的光谱特性，获得样品本身的激发光谱，这一过程称为光谱校正，所得到的得样品本身的激发光谱，这一过程称为光谱校正，所得到的光谱称为样品的真实激发光谱。光谱称为样品的真实激发光谱。 b发射光谱发射光谱 当用某一固定当用某一固定波长的单色光照射样品，而让其产生波长的单色光照射样品，而让其产生的荧光经过波长延续变化的单色器时，所得到的以荧光发射的荧光经过波长延续变化的单色器时，所得到的以荧光发射波长为横坐标、荧光强度为纵坐标的荧光谱图，称为发射光波长为横坐标、荧光强度为纵坐标的荧光谱图，称为发射光谱。发射光谱中的峰值称为发射峰，其波长称为发射波长。谱。发射光谱中的峰值称为发射峰，其波

38、长称为发射波长。发射波长与激发波长一样也是鉴别物质的根据。同时发射波长与激发波长一样也是鉴别物质的根据。同时与激发光谱一样，发射光谱也有表观发射光谱与真实发射光与激发光谱一样，发射光谱也有表观发射光谱与真实发射光谱之分，实验中也须首先对仪器进展发射光谱校正，才干得谱之分，实验中也须首先对仪器进展发射光谱校正，才干得到物质的真实发射光谱。到物质的真实发射光谱。 除个别物质例外，物质的真实发射光谱的外形与激发除个别物质例外，物质的真实发射光谱的外形与激发波长的选择无关，但用不同的激发波长所得到的发射光强度波长的选择无关，但用不同的激发波长所得到的发射光强度不同。用激发波长时所得到的发射光强度最强，

39、越是远离激不同。用激发波长时所得到的发射光强度最强，越是远离激发峰的波长，所得发射波长越小。发峰的波长，所得发射波长越小。反过来，物质的真实激发光谱的外形和强度与发射波反过来，物质的真实激发光谱的外形和强度与发射波长的选择也有类似的规律。长的选择也有类似的规律。 c荧光强度及荧光总量荧光强度及荧光总量 荧光强度是指荧光物质在一定强度的紫外光照射下所荧光强度是指荧光物质在一定强度的紫外光照射下所发出的荧光的强度。荧光强度与仪器性能、激发光强度及样发出的荧光的强度。荧光强度与仪器性能、激发光强度及样品浓度、样品发射荧光效率等有关，因此荧光强度的绝对值品浓度、样品发射荧光效率等有关，因此荧光强度的绝

40、对值不易丈量，大多数荧光分光光度计都用相对荧光强度来表示不易丈量，大多数荧光分光光度计都用相对荧光强度来表示样品发射荧光的强弱。样品发射荧光的强弱。荧光强度无量纲。荧光物质的稀溶液的荧光强度与其荧光强度无量纲。荧光物质的稀溶液的荧光强度与其浓度成正比，因此可用荧光强度进展定量分析。浓度成正比，因此可用荧光强度进展定量分析。 当不用某一波长的荧光来表示某物质发射的荧光强弱当不用某一波长的荧光来表示某物质发射的荧光强弱，而用该物质的发射光谱的面积来表示荧光的强弱，称为总，而用该物质的发射光谱的面积来表示荧光的强弱，称为总荧光量。荧光量。普通在滤光片式荧光计上测得的读数即为样品的总荧普通在滤光片式荧

41、光计上测得的读数即为样品的总荧光量。光量。荧光分光光度计上直接测得的是荧光强度，而总荧光荧光分光光度计上直接测得的是荧光强度，而总荧光量那么可经过对波长积分求得。量那么可经过对波长积分求得。用总荧光量定量可进一步提高检测灵敏度。用总荧光量定量可进一步提高检测灵敏度。二、二、 荧光光谱法定性定量方法荧光光谱法定性定量方法(1)(1)定性方法定性方法 由于荧光光谱的外形和荧光峰的位置对于由于荧光光谱的外形和荧光峰的位置对于荧光物质是有其特征的，荧光物质是有其特征的， 因此可利用其特征激因此可利用其特征激发波长和特征发射波长作为定性根据。发波长和特征发射波长作为定性根据。荧光法定性常采用直接比较法，

42、即将未知荧光法定性常采用直接比较法，即将未知样品与知规范物质在一样的测试条件下测定其激样品与知规范物质在一样的测试条件下测定其激发光谱和发射光谱，然后加以比较，鉴定能否为发光谱和发射光谱，然后加以比较，鉴定能否为同一物质。同一物质。(2)(2)定量方法定量方法a a荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系 荧光是由物质在吸收光能之荧光是由物质在吸收光能之后发射出的，溶液发射荧光的强度与诸有关要素的关系可用下后发射出的，溶液发射荧光的强度与诸有关要素的关系可用下式表示：式表示：F=F=I0I0CLCLF_F_溶液的荧光强度溶液的荧光强度_荧光物质的荧光效率荧光物质的荧光效率I0_I0_激

43、发光强度激发光强度_吸光系数吸光系数( (与溶液性质及仪器性能有关与溶液性质及仪器性能有关) )C_C_样品液浓度样品液浓度L_L_液层厚度液层厚度( (样品池厚度样品池厚度) )上式阐明：对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强上式阐明：对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的激发光照射，以及其他仪器条件和环境条件一定的条件下度的激发光照射，以及其他仪器条件和环境条件一定的条件下，荧光强度与溶液中荧光物质的浓度成正比。，荧光强度与溶液中荧光物质的浓度成正比。b b荧光定量分析的方法荧光定量分析的方法上式即荧光定量分析的根据。与吸收光谱法中的上式即荧光定量分析的根据。与吸收光谱法中

44、的郎伯郎伯比耳定律根本一致。比耳定律根本一致。目前，荧光目前，荧光 光谱法大多用于荧光物质的定量分光谱法大多用于荧光物质的定量分析，分析方法与吸收光谱法根本一样，吸收光谱法中的析，分析方法与吸收光谱法根本一样，吸收光谱法中的规范曲线法、对照计算法、列解联立方程法、双波长法规范曲线法、对照计算法、列解联立方程法、双波长法及导数法、差示光谱法等均适用于荧光光谱法。及导数法、差示光谱法等均适用于荧光光谱法。(3)(3)荧光分析的干扰要素荧光分析的干扰要素a a溶剂的影响溶剂的影响 选择适宜的溶剂选择适宜的溶剂 所用溶剂不应在紫外光范围有光所用溶剂不应在紫外光范围有光吸收，如苯、丙酮、酚等，就不宜在紫

45、外光范围运用。吸收，如苯、丙酮、酚等，就不宜在紫外光范围运用。另应留意同一荧光物质在不同溶剂中荧光光谱的外形和另应留意同一荧光物质在不同溶剂中荧光光谱的外形和强度也有显著不同。例如硫酸奎宁在硫酸中有荧光而在强度也有显著不同。例如硫酸奎宁在硫酸中有荧光而在盐酸中无荧光。盐酸中无荧光。 溶剂应有足够的纯度溶剂应有足够的纯度 溶剂中的杂质会干扰待测样溶剂中的杂质会干扰待测样品的荧光，或使其加强，或使其减品的荧光，或使其加强，或使其减 弱，影响定量准确弱，影响定量准确性，必要时需对溶剂加以处置。例如：乙醇可加氢氧化性，必要时需对溶剂加以处置。例如：乙醇可加氢氧化钾蒸馏，正丁酸、正庚烷、二氯丁烯、乙醚等

46、可用钾蒸馏，正丁酸、正庚烷、二氯丁烯、乙醚等可用o o1M1M盐酸和盐酸和0 01M1M氢氧化钠洗后再用水洗，无离子水有时氢氧化钠洗后再用水洗，无离子水有时也有荧光，运用二重或三重蒸馏水。也有荧光，运用二重或三重蒸馏水。b b实验器具的影响实验器具的影响 光滑油有很强的荧光，留意运用分液漏斗等带活光滑油有很强的荧光，留意运用分液漏斗等带活塞的器具的，活塞上不要涂油。塞的器具的，活塞上不要涂油。橡皮塞和软木塞也是荧光污染源，运用时应包以橡皮塞和软木塞也是荧光污染源，运用时应包以锡纸。锡纸。洗涤剂有时也有很强荧光，重铬酸钾洗液也有紫洗涤剂有时也有很强荧光，重铬酸钾洗液也有紫外吸收，因此在洗涤器皿时

47、应冲洗干净，然后再用半浓外吸收，因此在洗涤器皿时应冲洗干净，然后再用半浓硝酸煮沸后漂洗，再在蒸馏水中煮沸。硝酸煮沸后漂洗，再在蒸馏水中煮沸。c c温度的影响温度的影响 温度对溶液的荧光性质有显著影响，普通来说，温度对溶液的荧光性质有显著影响，普通来说，溶液的荧光强度随温度的降低而加强。溶液的荧光强度随温度的降低而加强。由于温度降低时介质粘度添加，因荧光物质分子由于温度降低时介质粘度添加，因荧光物质分子与溶剂分子的碰撞与溶剂分子的碰撞 而引起的非辐射能耗减少的缘故，而引起的非辐射能耗减少的缘故，所以在荧光分析中一定要坚持样品环境温度的稳定。所以在荧光分析中一定要坚持样品环境温度的稳定。d d溶液

48、溶液pHpH值的影响值的影响溶剂溶剂pHpH值的变化对荧光强度有很大影响。值的变化对荧光强度有很大影响。由于大多数芳香性荧光物质都带有酸或碱基因，由于大多数芳香性荧光物质都带有酸或碱基因，因此它们对因此它们对pHpH的变化很敏感。例如苯酚可视为弱酸，它的变化很敏感。例如苯酚可视为弱酸，它在酸性溶液中以分子方式存在，呈现荧光，但在碱性溶在酸性溶液中以分子方式存在，呈现荧光，但在碱性溶液中那么以苯酸阴离子方式存在而不发荧光。液中那么以苯酸阴离子方式存在而不发荧光。所以在荧光分析中严厉坚持溶液的所以在荧光分析中严厉坚持溶液的pHpH值非常重要值非常重要。e e荧光淬灭荧光淬灭 荧光淬灭是指由于荧光物

49、质分子与溶剂分子或其他溶荧光淬灭是指由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作质分子的相互作 用所引起的荧光强度降低的景象。用所引起的荧光强度降低的景象。荧光溶液浓度过大时，也常发生自淬灭景象，使荧光荧光溶液浓度过大时，也常发生自淬灭景象，使荧光强度与试样浓度的关系曲线向下弯曲而失去线性关系，所以强度与试样浓度的关系曲线向下弯曲而失去线性关系，所以在测试浓溶液时应留意检查线性范围。在测试浓溶液时应留意检查线性范围。f f光分解光分解 荧光物质大多对光很不稳定，特别在稀溶液中，在自荧光物质大多对光很不稳定，特别在稀溶液中，在自然光或强激发光源照射下，光敏感物质的光分解很明显。在然光或强激发

50、光源照射下，光敏感物质的光分解很明显。在荧光丈量期间时间稍长荧光读数就会渐渐下降，甚至荧光峰荧光丈量期间时间稍长荧光读数就会渐渐下降，甚至荧光峰也产生位移。也产生位移。因此在测定光敏物质时，最好运用弱光源，在样品有因此在测定光敏物质时，最好运用弱光源，在样品有多个激发波长时尽量运用波长较长的低能量激发光。在测定多个激发波长时尽量运用波长较长的低能量激发光。在测定时要留意及时封锁光闸，尽量缩短测定时间。在制样过程中时要留意及时封锁光闸，尽量缩短测定时间。在制样过程中应尽量防止光照，尽量在暗室操作或将样品包以黑纸。应尽量防止光照，尽量在暗室操作或将样品包以黑纸。 荧光分析非常灵敏，干扰要素也较多，

51、很多细节留意不荧光分析非常灵敏，干扰要素也较多，很多细节留意不到，都能够导致实验失败。到，都能够导致实验失败。三、三、 荧光仪器的根本构成荧光仪器的根本构成1.1.激发光源激发光源常见的紫外一可见区激发光源有钨灯、氘灯、汞常见的紫外一可见区激发光源有钨灯、氘灯、汞灯、氙灯等，激发光源应有足够的光强度和稳定性。灯、氙灯等，激发光源应有足够的光强度和稳定性。目前大多数荧光分光光度计均采用高压氙灯作为目前大多数荧光分光光度计均采用高压氙灯作为光源，由于氙灯能在紫外一可见提供较好的延续光谱，光源，由于氙灯能在紫外一可见提供较好的延续光谱，缺陷是稳定性较差，需求性能较高的电源。缺陷是稳定性较差，需求性能

52、较高的电源。2. 2. 单色器单色器目前大多数荧光分光光度计都采用衍目前大多数荧光分光光度计都采用衍射光栅单色器。荧光分光光度计有两个单射光栅单色器。荧光分光光度计有两个单色器，激发单色器和发射单色器，前者用色器，激发单色器和发射单色器，前者用于从复合光源中选出单一波长的激发光，于从复合光源中选出单一波长的激发光，后者用于从复合荧光发射光中选出单一发后者用于从复合荧光发射光中选出单一发射波长。射波长。3. 3. 样品池样品池 荧光分光光度计所用的样品池与紫外荧光分光光度计所用的样品池与紫外光度计类似，有玻璃池和石英池两种，前光度计类似，有玻璃池和石英池两种，前者用于可见光，后者用于紫外光区。者

53、用于可见光，后者用于紫外光区。4.4.检测器检测器目前大多数荧光分光光度计均采用灵目前大多数荧光分光光度计均采用灵敏度较高的光电倍增管作检测器。敏度较高的光电倍增管作检测器。四、荧光分光光度计的任务原理氙灯光源的发光氙灯光源的发光 单色器单色器样品池样品池样样品被激发品被激发 荧光经滤光片和发射单色器荧光经滤光片和发射单色器荧荧光检测器光检测器荧光强度电信号荧光强度电信号中央处置机中央处置机信信号输给记录仪绘出谱图或直接在荧号输给记录仪绘出谱图或直接在荧 光屏显示。光屏显示。 初始化设置阶段，插入镜插入光路，光线初始化设置阶段，插入镜插入光路，光线进入激发单色器，又穿过束分裂器，汞灯的一进入激

54、发单色器，又穿过束分裂器，汞灯的一部分光经光导纤维束进入发射单色器，汞灯的部分光经光导纤维束进入发射单色器，汞灯的某个线光谱被用于波长和光谱带通校正。经束某个线光谱被用于波长和光谱带通校正。经束分裂器分裂的汞灯的另一部分光被导入监视检分裂器分裂的汞灯的另一部分光被导入监视检测器，监视检测器的输出信号沿荧光检测器一测器，监视检测器的输出信号沿荧光检测器一样的途径送记录仪记录。样的途径送记录仪记录。五、仪器校正1.1.激发光谱校正激发光谱校正 目的：扣除激发光源和激发单色器的光谱目的：扣除激发光源和激发单色器的光谱特性的影响，获得样品的真实激发光谱。特性的影响，获得样品的真实激发光谱。目前大多仪器

55、利用荧光物质罗丹明目前大多仪器利用荧光物质罗丹明B B的浓溶液的的浓溶液的荧光发射来校正激发光谱。荧光发射来校正激发光谱。根本原理根本原理: :罗丹明罗丹明B B的荧光强度只随激发光的荧光强度只随激发光强度变化而不随激发光波长而变化，即其发射强度变化而不随激发光波长而变化，即其发射光谱的外形与激发光的光谱外形一样。如日立光谱的外形与激发光的光谱外形一样。如日立850850荧光计就是先对罗丹明荧光计就是先对罗丹明B B溶液进展激发光谱溶液进展激发光谱扫描，计算机自动将罗丹明扫描，计算机自动将罗丹明B B的发射光谱记忆下的发射光谱记忆下来，然后从样品的表观激发光谱中扣除。得到来，然后从样品的表观激

56、发光谱中扣除。得到样品的真实光谱。样品的真实光谱。2.2.发射光谱校正发射光谱校正目的：扣除发射单色器和光电倍增管的光目的：扣除发射单色器和光电倍增管的光谱特性的影响。谱特性的影响。 日立日立850850荧光分光光度计是采用将激发光直荧光分光光度计是采用将激发光直接引入发射单色器的方法。将一公用的散射器接引入发射单色器的方法。将一公用的散射器插在样品架上，激发光经散射器散射到发射单插在样品架上，激发光经散射器散射到发射单色器上，令激发侧和发射侧同时扫描，检测器色器上，令激发侧和发射侧同时扫描，检测器检出包括激发光光谱在内的发射侧光谱检出包括激发光光谱在内的发射侧光谱( (后者反后者反映了发射单

57、色器和光电倍增管光谱特性映了发射单色器和光电倍增管光谱特性) )，再从，再从中扣除激发光谱即得到发射侧光谱。计算机将中扣除激发光谱即得到发射侧光谱。计算机将其记忆下来，再自动从样品的表观发射光谱中其记忆下来，再自动从样品的表观发射光谱中扣除之，即得样品的真实发射光谱。扣除之，即得样品的真实发射光谱。2.2.波长检查波长检查 新安装经较长期运用的仪器，及改换了光学部件的新安装经较长期运用的仪器，及改换了光学部件的仪器需进展波长检查，以核对波长读数与真实值能否一致。仪器需进展波长检查，以核对波长读数与真实值能否一致。利用线性光源汞灯的知规范谱线。汞灯有利用线性光源汞灯的知规范谱线。汞灯有1313条

58、波长条波长准确不变的谱线如准确不变的谱线如43543583nm83nm和和546nm 546nm ，检查激发单，检查激发单色器和发射单色器的波长精度。色器和发射单色器的波长精度。检查时，先调出波长检查程序，此时仪器自动在光检查时，先调出波长检查程序，此时仪器自动在光路中插入一插入镜将氙灯光线挡住而将公用于校准的汞线路中插入一插入镜将氙灯光线挡住而将公用于校准的汞线引入激发单色器，然后由光束分别器直接引入监视检测器引入激发单色器，然后由光束分别器直接引入监视检测器( (不经样品室和发射单色器不经样品室和发射单色器) )，从，从545nm545nm开场作开场作546nm546nm附近的附近的光谱扫

59、描，监视检测器测得的激发光谱信号送计算机处置，光谱扫描，监视检测器测得的激发光谱信号送计算机处置，核对荧光屏上显示的峰值波长应在核对荧光屏上显示的峰值波长应在54.0754.070 02nm2nm以内。以内。六、仪器参数的选择六、仪器参数的选择1 1激发单色器和发射单色器狭缝宽度的选择激发单色器和发射单色器狭缝宽度的选择狭缝宽度表示方法：狭缝宽度表示方法：带通：用狭缝实践宽度表示，单位为带通：用狭缝实践宽度表示，单位为mmmm。带宽：用谱带波长范围表示，单位为带宽：用谱带波长范围表示，单位为nmnm。日立日立850850用带宽表示，可供选择的范围是用带宽表示，可供选择的范围是0020nm20n

60、m。特点：狭缝宽度较大时，透过光强度较大，灵特点：狭缝宽度较大时，透过光强度较大，灵敏度较高，但分辨率较低；狭缝宽度较小时，透过光敏度较高，但分辨率较低；狭缝宽度较小时，透过光强度较小，灵敏度较低，但分辨率较高。强度较小，灵敏度较低，但分辨率较高。定性分析选择较小的狭缝宽度；定量分析选择定性分析选择较小的狭缝宽度；定量分析选择较大的狭缝宽度。较大的狭缝宽度。在作激发光谱扫描时为得到激发光谱线细节，在作激发光谱扫描时为得到激发光谱线细节，同时兼顾光强度，可选择较小的激发侧狭缝宽度和较同时兼顾光强度，可选择较小的激发侧狭缝宽度和较大的发射侧狭缝宽度；大的发射侧狭缝宽度；同理，在作发射光谱扫描时那么