流式细胞仪的应用

1、 参考文献：参考文献： 临床流式细胞分析临床流式细胞分析王建中主编王建中主编 流式细胞术与生物医学左连富主编流式细胞术与生物医学左连富主编 现代免疫学实验技术周汝麟现代免疫学实验技术周汝麟 沈关心沈关心 主编主编 思考题：思考题： 流式细胞仪的三大应用范围流式细胞仪的三大应用范围 1，流式细胞仪的免疫荧光检测；，流式细胞仪的免疫荧光检测； 2，流式细胞仪的细胞周期检测；，流式细胞仪的细胞周期检测； 3，流式细胞仪的细胞分选；，流式细胞仪的细胞分选； 联系方式：联系方式： 治道楼治道楼1003室室 54237572 孙淑惠孙淑惠流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用名称名称:流式细胞术流式细胞术:(f

2、low cytometry)流式细胞仪流式细胞仪:(flow cytometer, FCM)荧 光 激 光 分 类 仪荧 光 激 光 分 类 仪 ( f l u o r e s c e n t activated cell sorter, FACS)机型机型 本教研室有两台流式细胞仪，都是本教研室有两台流式细胞仪，都是BD公公司司(BECTON-DICKINSON)生产的。生产的。 1.分析型流式细胞仪：分析型流式细胞仪：BD FACSCalibur 检测标记细胞的百分比含量。检测标记细胞的百分比含量。 同时检测四色不同染色的细胞。同时检测四色不同染色的细胞。 2.分选型流式细胞仪：分选型流式

3、细胞仪：BD FACSAria 无菌获取阳性细胞，以进一步培养。无菌获取阳性细胞，以进一步培养。 同时获取四色不同染色的细胞。同时获取四色不同染色的细胞。定义定义 流式细胞术是以高能量流式细胞术是以高能量激光激光照射高速流动状态照射高速流动状态下被荧光色素染色的下被荧光色素染色的单细胞单细胞或颗粒，测量其产或颗粒，测量其产生的散射光和发射生的散射光和发射荧光荧光的强度，从而对细胞的强度，从而对细胞（或微粒）进行定性或定量检测的一种细胞分（或微粒）进行定性或定量检测的一种细胞分析技术。由于流式细胞术可同时鉴别单个细胞析技术。由于流式细胞术可同时鉴别单个细胞上的多种抗原，而且在极短时间内分析大量细

4、上的多种抗原，而且在极短时间内分析大量细胞，因此在医学基础研究和临床疾病的诊断、胞，因此在医学基础研究和临床疾病的诊断、治疗及发病机制研究中得到了广泛应用。治疗及发病机制研究中得到了广泛应用。特点特点 1,1,各种组织细胞均可用于分析各种组织细胞均可用于分析, ,如血液、骨如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞等，实体组织髓、体液中的细胞、培养细胞等，实体组织经处理后制成单细胞悬液均能分析经处理后制成单细胞悬液均能分析。 2,2,测量速度快，每分钟能测量数千至数万个测量速度快，每分钟能测量数千至数万个细胞。细胞。 3, ,可进行多参数的分析可进行多参数的分析, , 可可同时检测同时检测四种不四种

5、不同荧光染色的细胞。新一代的流式可同时检同荧光染色的细胞。新一代的流式可同时检测十多色的细胞。测十多色的细胞。 4 4, ,可将目的细胞无菌分选出来做进一步的培可将目的细胞无菌分选出来做进一步的培养。养。流式细胞仪的主要应用范围 1，流式细胞仪的免疫荧光检测；，流式细胞仪的免疫荧光检测； 2，流式细胞仪的细胞周期检测；，流式细胞仪的细胞周期检测； 3，流式细胞仪的细胞分选；，流式细胞仪的细胞分选；（一）在免疫学中的应用（一）在免疫学中的应用-重要的免疫学实验技术 抗原抗原(antigen，Ag)是指能刺激机体是指能刺激机体免疫系统诱导免疫应答并能与应答免疫系统诱导免疫应答并能与应答产生如产生如

6、抗体抗体或致敏淋巴细胞发生特或致敏淋巴细胞发生特异反应的物质。异反应的物质。 抗原多为相对分子质量在抗原多为相对分子质量在10,000以上以上的蛋白质和多糖大分子的蛋白质和多糖大分子.淋巴细胞免疫表型分析淋巴细胞免疫表型分析 根据淋巴细胞的功能及膜表面标记，根据淋巴细胞的功能及膜表面标记，主要分为主要分为T淋巴细胞、淋巴细胞、B淋巴细胞和淋巴细胞和NK细胞三个亚群，但三者在普通细胞三个亚群，但三者在普通光学显微镜下不能区分，血细胞分光学显微镜下不能区分，血细胞分析仪也无法鉴别，只有用流式细胞析仪也无法鉴别，只有用流式细胞仪结合单克隆抗体技术才能准确分仪结合单克隆抗体技术才能准确分类计数淋巴细胞

7、亚群。类计数淋巴细胞亚群。T细胞在胸腺内的发育过程细胞在胸腺内的发育过程 CD34+ CD2- CD4- CD8- TCR- CD2+ CD4- CD8- TCR- CD2+ CD3+ CD4- CD8- TCR+/- CD1+ CD2+ CD3+ CD4+ CD8+ TCR+/-CD2+ CD3+ CD4+ CD8- TCR+ CD2+ CD3+ CD4 - CD8+ TCR+经常测定的淋巴细胞免疫标记包括：经常测定的淋巴细胞免疫标记包括：T淋巴细胞淋巴细胞：CD3、CD4、CD8,T辅助细胞辅助细胞：CD3+CD4+,T抑制细胞抑制细胞：CD3+CD8+,B淋巴细胞：淋巴细胞：CD19、或

8、或CD20，NK细胞细胞：CD56、CD16，活化细胞：活化细胞：CD25、HLA-DR、 CD40L、CD71。流式检测人外周血淋巴细胞亚群流式检测人外周血淋巴细胞亚群的正常参考范围的正常参考范围CD3+70.012.0%CD3+CD4+CD8-40.09.0%CD3+CD4-CD8+30.08.0%CD3-CD56+(NK)12.08.0%CD19+8.03.0%CD4+/CD8+比值：比值：1.0-2.5R1File: Data.002Acquisition Date: 29-Jun-99QuadEvents% GatedCD19+17711.81CD19+CD3+20.13CD19-C

9、D3-40426.95CD3+91661.11File: 2005/7/14 Dong LN.026Acquisition Date: 30-Jan-04Gated Events: 86713Total Events: 100000QuadEvents% Gated% TotalUL3961545.6939.62UR8490.980.85LL1371215.8113.71LR3253737.5232.54File: 2005/2/28 319 Zhou.609Acquisition Date: 28-Feb-05Quad% Gated% TotalUL22.866.78UR1.550.46LL

10、18.315.43LR57.2816.99File: 2003/12/5 PBMC-2 Chen.004Acquisition Date: 05-Dec-03QuadEvents% GatedUL36711.07UR2056.18LL117035.28LR157447.47File: 2003/12/5 PBMC-2 Chen.003Acquisition Date: 05-Dec-03QuadEvents% GatedUL51619.25UR220.82LL127247.46LR87032.46R2File: 2005/2/28 348 Zhou.615Acquisition Date: 2

11、8-Feb-05Quad % Gated % TotalUL44.2310.76UR0.950.23LL3.950.96LR50.8812.381，原发性免疫缺陷病：，原发性免疫缺陷病：T淋巴细胞缺乏，或淋巴细胞缺乏，或B淋巴淋巴细胞缺乏或减少。细胞缺乏或减少。2，HIV感染与感染与AIDS：CD4+淋巴细胞的百分比和淋巴细胞的百分比和数量减低。数量减低。3，SARS： T淋巴细胞（淋巴细胞（CD3+细胞）绝对数减少细胞）绝对数减少最为显著。最为显著。4，自身免疫性疾病：，自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、类风湿关系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、自身免疫干炎等患者节炎、自身免疫干炎等患者CD4+/

12、CD8+细胞比值细胞比值异常。异常。5，造血干细胞移植后免疫重建：，造血干细胞移植后免疫重建：NK细胞首先开细胞首先开始升高，随后始升高，随后T淋巴细胞和淋巴细胞和B淋巴细胞开始恢复，淋巴细胞开始恢复，CD4+/CD8+细胞比值约在第二年才能逆转（细胞比值约在第二年才能逆转（1）。）。6，移植后免疫监测：，移植后免疫监测：动态监测血液动态监测血液CD2+、CD3+、CD25+表达的变化，当其持续增高时提示发生移表达的变化，当其持续增高时提示发生移植排斥反应；植排斥反应； CD4+/CD8+细胞比值持续减低表示细胞比值持续减低表示移植后感染，若比值移植后感染，若比值0.2时应停用免疫抑制剂，以时

13、应停用免疫抑制剂，以免继发严重感染而导致移植失败。免继发严重感染而导致移植失败。7，实体肿瘤疗效观察：，实体肿瘤疗效观察：恶性肿瘤患者治疗前恶性肿瘤患者治疗前CD3+细胞数量、细胞数量、CD4+/CD8+细胞比值常减低，化细胞比值常减低，化疗或放疗有效时则可逐渐恢复或达到正常水平。疗或放疗有效时则可逐渐恢复或达到正常水平。淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常较好。后常较好。（二）在血液学中的应用：（二）在血液学中的应用：概念：白细胞分化抗原概念：白细胞分化抗原(DC) CD (cluster of differentiation)指的是分化指

14、的是分化群或分化簇。在使用群或分化簇。在使用CD命名细胞膜表面命名细胞膜表面免疫标志的初期，他专职白细胞膜上的免疫标志的初期，他专职白细胞膜上的抗原或抗原识别的抗体，故又称白细胞抗原或抗原识别的抗体，故又称白细胞分化抗原。分化抗原。 目前目前“CD”代表的不仅仅是白细胞表面代表的不仅仅是白细胞表面抗原，还有红细胞膜表面抗原、血小板抗原，还有红细胞膜表面抗原、血小板表面抗原、髓系细胞表面抗原及其他组表面抗原、髓系细胞表面抗原及其他组织细胞表面或细胞内的抗原等，研究方织细胞表面或细胞内的抗原等，研究方法以流式细胞术检测法为主。法以流式细胞术检测法为主。2，白血病的免疫分型：，白血病的免疫分型：白血

15、病免疫学分型是利用单克隆抗体白血病免疫学分型是利用单克隆抗体(McAb) 检测白血病细胞的细胞膜和细检测白血病细胞的细胞膜和细胞浆抗原（胞浆抗原（CDCD）,分析其表现型分析其表现型,以了解被以了解被测白血病细胞所属细胞系列（测白血病细胞所属细胞系列（如髓系、红如髓系、红系、淋巴系等白血病系、淋巴系等白血病亚型）及其分化程度。亚型）及其分化程度。对白血病细胞抗原的分析研究有助于对白对白血病细胞抗原的分析研究有助于对白血病分型血病分型，为诊断和治疗提供依据。为诊断和治疗提供依据。 举例：举例：T系急性淋巴细胞白血病免疫系急性淋巴细胞白血病免疫表型特点（表型特点（T-ALL）：）：根据根据T淋巴细

16、胞在胸腺内的成熟顺序，将淋巴细胞在胸腺内的成熟顺序，将T-ALL分为早期、中期和晚期三类。早期分为早期、中期和晚期三类。早期T-ALL：表达表达CD7和和CD1a，CD4、CD8膜膜CD3均为阴性；中期均为阴性；中期T-ALL：除表达除表达CD7和和CD1a外，还表达外，还表达CD2、CD5，CD4/CD8同时表达，膜同时表达，膜CD3仍为阴性；晚期仍为阴性；晚期T-ALL：膜膜CD3为阳性，但丢掉为阳性，但丢掉CD1a，其他标志同其他标志同中期。通过检测中期。通过检测CD抗原来确定白血病分期。抗原来确定白血病分期。2 2，淋巴瘤免疫分型：，淋巴瘤免疫分型：淋巴瘤的免疫分型也是利用单克隆抗体淋

17、巴瘤的免疫分型也是利用单克隆抗体检测淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原检测淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原,分析其表现型分析其表现型,以了解被测淋巴瘤细胞所以了解被测淋巴瘤细胞所属细胞系列及其分化程度。如属细胞系列及其分化程度。如 B细胞细胞系淋巴瘤系淋巴瘤T/NK细胞系淋巴瘤淋巴细细胞系淋巴瘤淋巴细胞系以外的造血细胞肿瘤造血细胞以胞系以外的造血细胞肿瘤造血细胞以外的肿瘤等。外的肿瘤等。 3 3，残留白血病检测，残留白血病检测 ：是指白血病经治疗后获得完全缓解后体是指白血病经治疗后获得完全缓解后体内残留少量白血病细胞的状态。而少量内残留少量白血病细胞的状态。而少量的白血病细胞在形态学上难以辨认，因的

18、白血病细胞在形态学上难以辨认，因此，用流式细胞仪能够准确、快速地检此，用流式细胞仪能够准确、快速地检测残存白血病细胞，指导治疗。测残存白血病细胞，指导治疗。4 4，血小板功能分析，血小板功能分析 ：血小板质膜糖蛋白单克隆抗体血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41(GPIIb/IIIa)、CD61(GPIIb/IIIa)、CD42b(GPIb)、CD41b(GPIIb)、血小血小板颗粒膜糖蛋白板颗粒膜糖蛋白CD62p、CD63的测定的测定可供分析血小板功能状态，如可供分析血小板功能状态，如CD62p、CD63正常血小板不表达，当血小板活化正常血小板不表达，当血小板活化时表达明显增加，可用来测定活化血

19、小时表达明显增加，可用来测定活化血小板板 5 5，造血干，造血干/祖细胞测定：祖细胞测定： 造血干造血干/祖祖细胞移植细胞移植已广泛应用于治疗血已广泛应用于治疗血液肿瘤、实体瘤、某些遗传性疾病、免液肿瘤、实体瘤、某些遗传性疾病、免疫缺陷病等。疫缺陷病等。CD34分子是造血干细胞的分子是造血干细胞的重要标志重要标志。造血干造血干/祖细胞存在于外周血祖细胞存在于外周血中，但浓度很低，需用生长因子动员，中，但浓度很低，需用生长因子动员，使使CD34+CD34+细胞达到一定水平，才能进行移细胞达到一定水平，才能进行移植。植。（三）细胞周期分析：（三）细胞周期分析：DNA的含量随细胞周期的含量随细胞周期

20、(G1，S，G2，M)的各的各个时期呈现出周期性的变化：个时期呈现出周期性的变化：G1期，是细胞期，是细胞RNA和蛋白质的合成期，即和蛋白质的合成期，即DNA合成前期合成前期,此此时细胞核内时细胞核内DNA含量保持二倍体；进入含量保持二倍体；进入S期后，期后，DNA开始合成，即开始合成，即DNA合成期合成期,细胞核内细胞核内DNA的含量介于二倍体至四倍体之间；细胞进入的含量介于二倍体至四倍体之间；细胞进入G2期，即细胞分裂前期，期，即细胞分裂前期，DNA含量为四倍体含量为四倍体,直直到进入到进入M期，即细胞分裂期期，即细胞分裂期,细胞分成两个子细细胞分成两个子细胞胞,M期结束进入下一个细胞周期

21、。期结束进入下一个细胞周期。G1期期:DNA的含量为二倍体的含量为二倍体S期期:DNA的含量为二倍体至四倍体混合的含量为二倍体至四倍体混合G2,M期期:DNA的含量为四倍体的含量为四倍体Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2004/4/1 DNA Cai.007Date analyzed: 1-Apr-2004Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 74.15 % at 74.99 Di

22、p G2: 3.35 % at 152.63 Dip S: 22.50 % G2/G1: 2.04 %CV: 4.47Total S-Phase: 22.50 %Total B.A.D.: 2.11 % no aggsApoptosis: 8.56 % Mean: 40.67Debris: 11.80 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9502All cycle events: 7663Cycle events per channel: 97RCS: 1.626DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SCai Haibo (#7)FL2

23、-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2004/1/2 Liu DNA.008Date analyzed: 2-Jan-2004Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 62.10 % at 75.40 Dip G2: 10.02 % at 152.08 Dip S: 27.88 % G2/G1: 2.02 %CV: 4.61Total S-Phase

24、: 27.88 %Total B.A.D.: 0.36 % no aggsApoptosis: 0.27 % Mean: 53.00Debris: 7.07 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 8862All cycle events: 8212Cycle events per channel: 106RCS: 4.232DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SLiu Qiwei(#8)FL2-A-FL2-A0306090120R11, 细胞增殖周期各时相细胞数的比率细胞增殖周期各时相细胞数的比率: 在生物细胞核中，在生物细胞核中，DN

25、A含量并非恒定，含量并非恒定，随细胞增殖周期时相不同而发生变化。随细胞增殖周期时相不同而发生变化。因此，不同种类的细胞，其细胞各期因此，不同种类的细胞，其细胞各期（G0/1期期, S期期, G2/M期）百分比含量期）百分比含量是不同的。是不同的。 Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2005/7/13 Fan.001Date analyzed: 13766912-13768812Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 1

26、00.00 % Dip G1: 87.10 % at 74.89 Dip G2: 12.33 % at 148.93 Dip S: 0.57 % G2/G1: 1.99 %CV: 4.84Total S-Phase: 0.57 %Total B.A.D.: 0.02 % no aggsApoptosis: % Mean: Debris: 0.46 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9024All cycle events: 8982Cycle events per channel: 120RCS: 2.073DebrisDip G1Dip G2Dip SFL

27、2-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2004/11/4 Yang.002Date analyzed: 4-Nov-2004Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 72.83 % at 72.39 Dip G2: 7.77 % at 146.60 Dip S: 19.40 % G2/G1: 2.03 %CV: 3.41Total S-Phase:

28、19.40 %Total B.A.D.: 0.08 % no aggsApoptosis: 0.03 % Mean: 37.89Debris: 1.28 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9098All cycle events: 8979Cycle events per channel: 119RCS: 2.484DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SFL2-A-FL2-A0306090120R12,细胞增殖动力学细胞增殖动力学:DNA含量随细胞增殖周期各时含量随细胞增殖周期各时相而相而 发生变化发生变化,通过测定单个细胞通过测定

29、单个细胞DNA含量含量,可计可计G0/G1, S, G2/M各增殖细胞周期所占的百分比各增殖细胞周期所占的百分比. 3,分化诱导治疗分化诱导治疗是肿瘤化学治疗的一项重要方面是肿瘤化学治疗的一项重要方面, 由于静止期由于静止期(G0)细胞对化疗药物不敏感细胞对化疗药物不敏感,而增殖期而增殖期(S, G2/M)对化疗敏感性高对化疗敏感性高,如果将静止期细胞采用如果将静止期细胞采用分化诱导治疗法分化诱导治疗法,使其大量进入增殖细胞群使其大量进入增殖细胞群,再用对再用对增殖细胞有杀伤作用的药物增殖细胞有杀伤作用的药物,就可以就可以 杀伤大量的瘤杀伤大量的瘤细胞细胞.应用流式细胞仪作细胞周期分析就可以观

30、察应用流式细胞仪作细胞周期分析就可以观察该种药物的疗效并作预后估计该种药物的疗效并作预后估计.Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2003/12/15 Song.015Date analyzed: 15-Dec-2003Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 29.33 % at 74.41 Dip G2: 17.35 % at 146.95 Dip S: 53.32 % G2/G1:

31、1.97 %CV: 4.96Total S-Phase: 53.32 %Total B.A.D.: 0.39 % no aggsApoptosis: 0.00 % Mean: 37.92Debris: 9.75 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 4011All cycle events: 3620Cycle events per channel: 49RCS: 1.961DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SSong Xiaodong(#15)FL2-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)

32、050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2003/12/25 Song.004Date analyzed: 25-Dec-2003Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 29.40 % at 77.95 Dip G2: 38.48 % at 149.24 Dip S: 32.13 % G2/G1: 1.91 %CV: 8.25Total S-Phase: 32.13 %Total B.A.D.: 1.75 % no aggsApopt

33、osis: 0.20 % Mean: 45.15Debris: 9.33 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 7630All cycle events: 6904Cycle events per channel: 95RCS: 3.962DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SSong Xiaodong(#4)FL2-A-FL2-A0306090120R1Channels050100150200250Channels050100150200250(四四) 细胞凋亡检测：细胞凋亡检测：1，亚，亚G1峰检测：峰检测：凋亡细胞最突出的形态凋亡

34、细胞最突出的形态学特征是细胞核固缩、染色质浓集、细胞体学特征是细胞核固缩、染色质浓集、细胞体变圆皱缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化变圆皱缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤为突出。染色质浓集是由于凋亡细胞双链尤为突出。染色质浓集是由于凋亡细胞双链DNA发生裂解所致。发生裂解所致。DNA降解后，形成长降解后，形成长度为度为180-200bp的的DNA片段，称凋亡小体。片段，称凋亡小体。即在流式细胞检测上可出现亚二倍体即在流式细胞检测上可出现亚二倍体(G1)峰峰值。而常规坏死的值。而常规坏死的DNA分解是随机的，分解是随机的，DNA 片段大小不一，在流式细胞检测上可片段大小不一，在流式细胞检测上可出

35、现比亚二倍体出现比亚二倍体(G1)峰更小的细胞碎片峰。峰更小的细胞碎片峰。Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2003/12/18 Wang.001Date analyzed: 18-Dec-2003Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 68.02 % at 80.51 Dip G2: 11.57 % at 157.26 Dip S: 20.40 % G2/G1: 1.95 %CV:

36、8.09Total S-Phase: 20.40 %Total B.A.D.: 0.42 % no aggsApoptosis: 8.76 % Mean: 43.50Debris: 3.55 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9168All cycle events: 8068Cycle events per channel: 104RCS: 2.778DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SFL2-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.

37、0(PMac)File analyzed: 2004/4/1 DNA Cai.007Date analyzed: 1-Apr-2004Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 74.15 % at 74.99 Dip G2: 3.35 % at 152.63 Dip S: 22.50 % G2/G1: 2.04 %CV: 4.47Total S-Phase: 22.50 %Total B.A.D.: 2.11 % no aggsApoptosis: 8.56 % Mean: 40.67Debr

38、is: 11.80 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9502All cycle events: 7663Cycle events per channel: 97RCS: 1.626DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SCai Haibo (#7)FL2-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2003/9/11 Chi DNA.004Date analyzed: 11-Sep-2003Mode

39、l: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 63.62 % at 75.01 Dip G2: 5.07 % at 160.16 Dip S: 31.30 % G2/G1: 2.14 %CV: 8.46Total S-Phase: 31.30 %Total B.A.D.: 16.89 % no aggsApoptosis: 16.68 % Mean: 38.65Debris: 40.63 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9670All cycle events: 47

40、84Cycle events per channel: 56RCS: 1.631DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SChi Zhanyou(TF)FL2-A-FL2-A0306090120R1Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2003/12/22 Wang.001Date analyzed: 22-Dec-2003Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 63

41、.31 % at 77.68 Dip G2: 8.36 % at 152.27 Dip S: 28.33 % G2/G1: 1.96 %CV: 4.71Total S-Phase: 28.33 %Total B.A.D.: 1.81 % no aggsApoptosis: 7.67 % Mean: 40.85Debris: 5.41 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 9109All cycle events: 7956Cycle events per channel: 105RCS: 2.901DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip S

42、FL2-A-FL2-A0306090120R12，Annexin V/PI 双染色法：双染色法：当细胞发生凋亡时，当细胞发生凋亡时，PS（磷酯酰丝氨酸）磷酯酰丝氨酸）从细胞膜内转移到细胞膜外，使从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露暴露在细胞膜表面，在细胞膜表面， Annexin V具有易于结具有易于结合合PS的磷脂结合蛋白。因此，建立一种的磷脂结合蛋白。因此，建立一种用用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡结合在细胞膜表面作为凋亡的指标并结合一种染料排除试验以检测的指标并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。该法使用细胞膜的完整性的检测方法。该法使用FITC标记标记Anne

43、xin V，同时结合使用同时结合使用PI拒染法。拒染法。File: 2005/11/30 Mou.007Acquisition Date: 30-Nov-05QuadEvents% Gated % Total X Geo MeanUL400.880.7243.30UR1643.622.95280.98LL312568.9456.157.68LR120426.5621.64276.07File: 2005/12/14 Shen.002Acquisition Date: 14-Dec-05QuadEvents% Gated % Total X Geo MeanUL8699.148.695.26UR

44、2522.652.5266.12LL782882.3078.284.94LR5625.915.6249.18File: 2005/7/13 Shen.001Acquisition Date: 30-Jan-04QuadEvents% Gated % Total X Geo MeanUL89010.578.904.11UR1972.341.9754.05LL584669.4558.464.55LR148417.6314.8448.58File: 2005/7/13 Shen.003Acquisition Date: 30-Jan-04QuadEvents% Gated % Total X Geo

45、 MeanUL7398.327.394.68UR2582.902.5845.94LL689077.5568.904.39LR99811.239.9845.78(五五)树突状细胞检测树突状细胞检测:树突状细胞树突状细胞(DC)是一类抗原呈递细胞是一类抗原呈递细胞（APC），），具有抗原递呈功能，并参与具有抗原递呈功能，并参与免疫调控功能。树突状细胞的分化发育免疫调控功能。树突状细胞的分化发育大致分为大致分为4个阶段，既从髓系个阶段，既从髓系DC前体到前体到未成熟期未成熟期DC、迁移期迁移期DC和成熟期和成熟期DC。CMRF-44，CMRF-56，CD83，CD25，共刺激分子共刺激分子(CD40

46、，CD80，CD86)，及及MHC II类分子等均为类分子等均为DC活化活化/成熟过程成熟过程中的标志物，可用流式细胞仪检测。中的标志物，可用流式细胞仪检测。 File: 2005/11/30 Wu.001Acquisition Date: 30-Nov-05QuadEvents% Gated % Total X Geo MeanUL190.050.0510.08UR1890.500.4636.87LL3698698.6689.993.59LR2960.790.7220.02ControlFile: 2005/12/5 Wu.007Acquisition Date: 05-Dec-05Quad

47、Events% Gated % Total X Geo MeanUL1850.440.376.60UR12452.972.49160.60LL2609662.3252.194.32LR1434534.2628.6943.87当你需要研究树突状细胞与免疫性疾当你需要研究树突状细胞与免疫性疾病的关系时，可以检测成熟病的关系时，可以检测成熟DC细胞细胞CD11c+细胞细胞，CD123+细胞在人体中所细胞在人体中所占的比例。占的比例。 它们增高，说明患者它们增高，说明患者DC呈呈递抗原水平高于正常人。由于递抗原水平高于正常人。由于CD11c+ DC是比是比CD123+DC更成熟的更成熟的DC，因此，因

48、此，病变局部的病变局部的CD123+细胞会比外周血中细胞会比外周血中CD123+细胞增高。说明病变局部的抗细胞增高。说明病变局部的抗原呈递高于周围组织。原呈递高于周围组织。LIN1：CD3、CD4、CD16、CD19、CD20、CD56。File: 2006/2/28 Shi.001Total Events: 50000GateEvents % Gated % TotalEvents excl. debris (R1)2887100.005.77lin 1 dim/-events (R2)2887100.005.77G32887100.005.77Basophils1796.200.36CD1

49、23+ DCs501.730.10G6571.970.11G72368.170.47File: 2006/2/28 Shi.001Total Events: 50000GateEvents % Gated % TotalEvents excl. debris (R1)45878100.0091.76lin 1 dim/-events (R2)28876.295.77G328876.295.77Basophils1790.390.36CD123+ DCs500.110.10G6570.120.11G72360.510.47R1R3R4R2LIN1：CD3、CD4、CD16、CD19、CD20、C

50、D56。File: 2006/2/28 Shi.002Total Events: 50000GateEvents % Gated % TotalEvents excl. debris (R1)3167100.006.33lin 1 dim/-events (R2)3167100.006.33G33167100.006.33Basophils611.930.12G52347.390.47CD11c+ DCs2347.390.47G737711.900.75File: 2006/2/28 Shi.002Total Events: 50000GateEvents % Gated % TotalEve

51、nts excl. debris (R1)43839100.0087.68lin 1 dim/-events (R2)31677.226.33G331677.226.33Basophils610.140.12G521064.804.21CD11c+ DCs2340.530.47G73770.860.75R1R2R5(六六)流式细胞仪的细胞因子检测：流式细胞仪的细胞因子检测： 细胞因子是由活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的细胞因子是由活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的,目前已多达目前已多达60余种余种, 细胞因子的检测方法大致分分子细胞因子的检测方法大致分分子生物学检测法和免疫学检测法生物学检测

52、法和免疫学检测法; 分子生物学检测法包括多聚酶链反应分子生物学检测法包括多聚酶链反应-PCR、原位杂原位杂交、交、Northern印迹试验和斑点杂交等方法印迹试验和斑点杂交等方法, 是测定是测定细细胞因子的基因胞因子的基因水平水平,包括包括DNA和和mRNA .但有时细胞虽但有时细胞虽然表达细胞因子的然表达细胞因子的基因基因, 并无分泌并无分泌细胞因子的细胞因子的功能功能. 免疫学检测法包括酶联免疫吸附检测法免疫学检测法包括酶联免疫吸附检测法-ELISA，酶酶联免疫斑点法联免疫斑点法-ELISPOT, 放射免疫检测法放射免疫检测法-RIA，流流式细胞仪检测的细胞内细胞因子和式细胞仪检测的细胞内

53、细胞因子和CBA（Cytometric Bead Array)等等.与与ELISA方法比较不同之处是可以确方法比较不同之处是可以确定分泌细胞因子的特异性细胞。定分泌细胞因子的特异性细胞。1,流式细胞仪的细胞内细胞因子检测：流式细胞仪的细胞内细胞因子检测：T淋巴细胞淋巴细胞(CD3+),T辅助细胞辅助细胞(CD3+CD4+),包括包括Th1,Th2.T抑制细胞抑制细胞 (CD3+CD8+),包括包括Tc1,Tc2.Th1细胞主要是细胞主要是CD4+细胞分泌细胞分泌IL-2、IL-12、IFN-g和和TNF-b/a等，主要介导细胞免疫应答。等，主要介导细胞免疫应答。Th2细胞主要是细胞主要是CD4

54、+细胞分泌细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6和和IL-10等，等，主要介导体液免疫应答。主要介导体液免疫应答。Tc1细胞主要是细胞主要是CD8+细胞分泌细胞分泌IFN-g、 IL-2、IL-6和和IL-10等。等。Tc2细胞主要是细胞主要是CD8+细胞分泌细胞分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和和IL-10等。等。Th1:CD4+IFN-g +Tc1:CD8+IFN-g +Th2:CD4+IL-4+Tc2:CD8+IL-4+Acquisition Date: 19-O ct-05Q uadEvents% G atedUL210830.63UR2844.13LL407659.22LR4

55、156.03File: 2003/12/26 Hu.007Acquisition Date: 26-Dec-03Quad% Gated% TotalUL7.945.57UR3.952.77LL65.3345.82LR22.7815.98File: 2002/5/31 Mao(1).003Acquisition Date: 31-May-2QuadEvents% GatedUL259130.93UR2082.48LL534363.77LR2362.82File: 2002/5/31 Ma0 (1).002Acquisition Date: 31-May-2QuadEvents% GatedUL393144.63UR2552.90LL427848.57LR3443.91IFN-r FITCIFN-r FITCCD8 PECD4 PEFile: 2003/3/28 Liver Zhang.014Acquisition Date: 28-Mar-3Gated Events: 83726Total Events: 100000RegionEvents% Gated% TotalR3460.050.05R21753820.