利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象

1、北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象化学学院 2000 级 葛宁目录第一章绪论 .1一、背景知识 .1二、关于 MjsHSP16.51第二章 试验内容及方法 .4一、 MjHSP16.5 的表达 .4二、 MjHSP16.5的分离与纯化 .6三、MjHSP16.5浓度的测定 .9四、丙稀酰胺对 Trp的荧光淬灭 .10 第三章 结果讨论 . .14 致谢 15参考文献 16北京大学校长基金论文集( 2003 年)利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象第一章 绪论、背景知识热休克蛋白 Heat Shock Prot

2、eins (HSPs),是在从细菌到哺乳动物中广泛存在一类热应 急蛋白质。当有机体暴露于高温的时候， 就会由热激发合成此种蛋白， 来保护有机体自身。 许多热休克蛋白具有分子伴侣活性。按照蛋白的大小，热休克蛋白共分为五类，分别为 HSP100， HSP90， HSP70， HSP60 以及小分子热休克蛋白small Heat Shock Proteins(sHSPs)( Kyeong et al., 1998。)小分子热休克蛋白分子量为 12-34KD ，它的分布极为广泛， 从细菌到人的基因组里都 有小分子热休克蛋白的基因。与其他大分子的热休克蛋白不同的是， 小分子热休克蛋白似乎对于细胞的功能并

3、不是 必不可少的。但是， sHSPs具有多种功能，包括赋予细胞以耐热性以抵抗高温，作为分子 伴侣以防止蛋白聚集， 对坑正常的细胞死亡， 从而调节细胞的生存和死亡的平衡。 能避免 底物变性的 sHSPs最少量与底物和热休克蛋白都有关 (Rosalind et al., 1998)。许多小分子热休克蛋白基因一般并不表达， 显著表达小分子热休克蛋白一般是细胞受 到外部刺激的时候， 比如高温刺激。现已发现， 除了热刺激之外还有许多物理、化学刺激 可以激活小分子热休克蛋白的表达，例如紫外线、射线、机械损伤、酸、氧化剂等等。可 见，小分子热休克蛋白是抵御外界不良刺激的重要物质。、关于 MjsHSP16.5

4、1蛋白的结构来自 Methanococcus jannaschi(i 一种甲烷球菌属古细菌)的热休克蛋白 MjHSP16.5， 相对分子量 16500kD，共 167 个氨基酸残基，是第一个有晶体结构数据的小热休克蛋白。 它的序列中存在一段长 90个残基的 -晶状体结构域(残基 46至 135)，此结构域与人的 A-晶状体蛋白有 20.7%的相似性，与水稻的 HSP16.9有 31.4%的相似性(Rosalind et al., 1998)。图 1. MjHSP16.5 的单体结构MjHSP16.5 的结构已经解出。它是一个中空的球状的 24 聚体，分子量约 16500kD。 聚合体的外径约

5、120?，内径约 65?。球的内部是空的，并没有明显的电荷密度。它具有非 常规则的结构，对称性包括 12 个二重轴， 3 个三重轴， 3 个四重轴， 8 个三重轴窗口， 6北京大学校长基金论文集( 2003 年)利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象个四重轴窗口，边长分别为 30 ?和 17 ?聚合体中的每一个折叠单位是由组成两个片的 结构、两个短的 310- 螺旋和一个短的结构组成的， 其中一个结构来自相邻的折叠单位。 蛋白 N-末端的 32 个氨基酸残基高度无序的。从第 33 个残基开始， 是蛋白的 -晶状体结构域，在蛋白的 C-末端还有一 段长 12 个残基的短小结构 (Dana A.

6、Haley et al., 2000)。每个蛋白的折叠单位大小为 25? 28?75?， 最长的方向与折叠片的长轴平行。MjHSP16.5 的 24 聚体中的每一个单 位都与其他单位有 很强的联系。 对应于 复合体中二重、三 重、四重对称轴，一 共存在三种折叠单 位间的相互作用。 最 强的相互作用存在 于二重轴周围： 一个 单位的 2- 折叠和另一单位的 6- 折叠通过形成氢键已形成单位间的折叠片，同时强烈的疏水相互作用和静电力也使该结构得到北京大学校长基金论文集( 2003 年) 利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象 稳定。在四重轴周围，由于氢键、静电力和疏水相互作用，四个分子互相接触。而

7、在三重 轴周围，单位间的作用力最弱，只有离子间作用力是三个单位组成的三角形顶角处稳定 ( Kyeong et al., 1998)。2 jHSP16.5 对细胞和蛋白的热保护实验表明，在表达了 MjHSP16.5 的大肠杆菌提取物中， 75%的蛋白在 80高温下因 为被保护而没有聚集沉淀，而提纯得到的 MjHSP16.5 对大肠杆菌提取物有相同的作用， 说明对大肠杆菌的热保护主要是由 MjHSP16.5 完成的。另外，对于变性温度为 80的单 链应乐果甜蛋白( single chain monellin )， MjHSP16.5 一样可以阻止其在变性温度下发生 聚集 (Rosalind et

8、al., 1998)。一种可能机制是，可能在体内，在这个过程中，蛋白或对细胞重要的 RNA 可以嵌入 MjHSP16.524聚球状体的空腔或表面。 另一种可能性是， MjHSP16.5 多聚体与他的功能和 活性无关，而是一种蛋白的储存状态： 当蛋白受到外界压力的时候， 多聚体就会迅速分解。北京大学校长基金论文集（ 2003 年）利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象第二章 实验内容及方法、 M jHSP16.5 的表达1.原理蛋白质表达是为获得大量的目标蛋白质而进行的有目的性的蛋白质合成。 常用方法是 将编码所需产物的基因插入质粒或其他载体，然后将该载体导入活细胞，进行大量合成。大多数克隆载体

9、都以大肠杆菌作为宿主。 因为大肠杆菌具有两个特征： 操作简易和能 在廉价的培 养基 上迅速的生长。在大肠杆菌里表达外源基因一般是始于将基因插入表达载体（一般是质粒） 。载体应 具有的几种元件有：选择标志的编码序列，它可供筛选以确定载体是否进入了细胞； 可控转录启动子，经诱导后从克隆化基因产生大量的 mRNA ； 转录调控序列，如一个合适的核糖体结合位点和起始密码子 ATG； 一个多限制酶位点接头，便于外源基因以正确方向插入载体中。 含有待表达基因的载体构建好后，经转化导入大肠杆菌某一合适菌株中。编码 MjHSP 16.5 的基因（ Mj285 ）已经从古细菌 Mathanococcus jan

10、naschii中得到克 隆，利用 PCR 技术扩增，并插入带有氨苄（ AMP.）抗性的载体 pET21a 质粒（ Novagen 出品）中。将此载体转化进入宿主 E.coli BL21（DE3） ，宿主体内含有质粒 pSJS1240，此质 粒含有可以编码 E.coli 的 tRNA 稀有密码子（精氨酸密码子 AGA 和异亮氨酸密码子 ATA），并带有壮观霉素 （Spectinomycin）抗性。 我们用含 Amp. 和 Spec. 的 LB 培养基来筛 选出可以表达 MjHSP 16.5的菌株。得到的菌株在适当条件下大量培养，即得到表达出所 需蛋白的细胞。2仪器和试剂仪器a） YXQG02 型

11、蒸汽消毒器：山东新华医疗仪器厂；b）LS-B50L 立 式 圆 形 压 力 蒸 汽 灭 菌 器 ： 张 家 港 市 华 菱 医 疗 设 备 制造有限公司；c） CS501-SP超级数显恒温器：重庆四达实验仪器厂；d） Model 4518 台式恒温培养摇床： Forma Scientific Inc.；e） Spectrumlab PC 22 分光光度计：上海棱光技术有限公司； .f） Sorvall RC 5C Plus冷冻离心机： Kendro Laboratory Products； 其他常规仪器： 电子分析天平； 漩涡混合器；一次性培养皿； 烧杯；锥形瓶；接种环； 酒精灯；微量移液器；

12、离心管（ 500ml，50ml）；一次性小离心管（ 1.5ml ，0.6ml）；滴管； 玻璃棒。北京大学校长基金论文集( 2003 年)利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象试剂a) LB 液体培养基： 每 100ml Tryptone：1g Yeast-extract：0.5g NaCl：1g 加水至 100ml并用 NaOH调 pH至 7b) LB 固体培养基：每 100ml 液体培养基中加入 1.5g 琼脂 (Agar-B)c) Ampicillin(Amp.) 50mg/ml每 10ml Ampicillin ： 500mg ddH2O：10mld) Spectinomycin(Spe

13、c.) 50mg/ml 每 10mlSpectinomycin：500mg ddH2O：10mle) 1 M IPTG 每 5ml IPTG：1.2g ddH2O： 4.5mlf) 0.8% NaCl 溶液 每 100ml NaCl ： 0.8g ddH2O：100ml注：配制 Ampicillin 和 Spectinomycin 时要无菌操作。在无菌环境中将配好的溶液过一次性滤器装入无菌细口瓶，于 4冰箱中保存。3实验步骤3.1转化质粒 pET21a：a)配制 LB 液体培养基两份各 50ml，LB 固体培养基一份 50ml。0.1MPa下灭菌 20min。b)待培养基冷却而固体培养基未凝固

14、时加入 50mg/ml Amp. 和 Spec. 各 50 l，摇匀， 倒平板。向一瓶液体培养基中加入 Amp. 和 Spec. 各 50l；另一瓶液体培养基中 加入 Spec. 50l。c)在含 Spec. 的液体培养基中加入 10l E.coli BL21(DE3) ，恒温摇床上 37， 150rpm 培养 6 小时，至 O.D. 至 0.6 左右北京大学校长基金论文集( 2003 年)利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象d)取 1ml 菌液，离心，弃上清液。e)加入 100l 0.1M CaCl 2重悬菌体沉淀，加入 3l pET21a质粒，振荡均匀。冰浴 30 分钟左右，保持细菌处于

15、感受态。f)于 42恒温水浴下热休克 45 秒(时间要精确)。g)冰浴 1 2 分钟。h)取 50 l 菌种于含 Amp. 和 Spec. 的固体培养基中，涂布均匀。在恒温摇床上于 37， 150rpm下培养 16小时左右。出现分布均匀的单菌落证明转化成功。3.2菌种保藏a)单菌落接入含 Amp. 和 Spec. 的培养基内，恒温摇床上 37，150rpm 下培养 8 小时左右，至 O.D.值为 1。b)取 1ml 菌液于 1.5ml 小离心管中，加入 80无菌甘油至终浓度 8%-10%，于 20 冰箱中保存。3.3大量培养：取菌种 200l 于 1L 已灭菌的 LB 培养液 (含 50g/m

16、l Amp. , 30g/ml Spec.) 中，37， 150rpm下摇床培养 8小时左右，至菌体 O. D. (600nm)值为 0.8-1 。3.4诱导：加入 IPTG 500l(终浓度为 0.5M)，继续在 37oC，150rpm下培养 2 小时左右 诱导过程中，菌不再生长。注：以上所有操作均在无菌条件下进行3.5收获菌体：将菌液于 4， 5000g下离心 10min；弃去上清液，用 0.8% NaCl 溶液重悬菌体， 再于 4， 5000g 下离心 10min；沉淀的菌体于 20下保存。二、 MjHSP 16.5 的分离与纯化：1. 原理：为了提高蛋白纯度，我们借鉴文献的纯化方法(

17、Kyeong Kyu Kim et al.,1998 )，摸索 出了一套纯化方法。 使用分离纯化生物大分子最高效液相色谱分离技术， 连续使用三种色 谱法：离子交换色谱，疏水作用色谱，凝胶过滤色谱。1.1离子交换色谱氨基酸是一种兼性离子，在生理条件下，羧基带负电，氨基带正电。由于不同的 氨基酸侧链不同，使其具有不同的酸碱性，从而在生理条件下又带上了额外的电荷。 自然，有大量氨基酸组合而成的蛋白质，也有可能是带电体。北京大学校长基金论文集( 2003 年)利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象离子交换色谱，是利用被分离物质带电性质不同而达到分离效果的一类液相色谱。 色谱柱的固定相上带有可解离的阳(

18、阴)离子，当带有同种电荷的物质流入柱内，会 将该种离子置换出来，从而停留在柱内。逐渐加大洗脱液的离子强度，或者改变体系 的 pH 值，都可能使新的离子取代被提纯物质的位置，从而是物质被洗脱下来。电荷 性质不同的物质，与固定相间的作用力不同，洗脱时间不同，从而达到分离提纯的效 果。1.2疏水层析 疏水层析是基于溶质，极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种 色谱模式。它利用分离的物质的疏水性质不同，而达到分离效果的。与疏水作用相对 的是静电作用力。在很高离子浓度时，被分离物质因为与柱内固定相间的疏水相互作 用而被停留在柱内。根据相似相容原理，降低洗脱液的离子强度，增加了流动相与被 分离

19、物质间的疏水作用，加大了物质离开固定相的趋势，直至被洗脱下来。1.3凝胶过滤色谱 凝胶过滤色谱是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果的，凝胶过滤填料 中含有大量微孔，只允许缓冲液以及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质以及 一些蛋白质复合物被阻挡在外。因此，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动， 比小分子量蛋白更早的被洗脱下来。最大的蛋白质分子最早流出柱子，因为它们 在到达柱底前经过的体积最小；中等的蛋白质可以进入填料分子中较大的孔内， 有最大的通过体积，故最后到达柱底。2.仪器和试剂 仪器 a)FPLC Fast protein, peptide, and polynucleotide liq

20、uid chromatography快 速(蛋白， 多肽，核酸)液相层析仪 ：PHARMACIA ；b)阴离子交换柱 5ml High-Trap Q 柱： PHARMACIA ；c)疏水柱 Hi PREP Octyl FFd)凝胶过滤柱为 Superose S200e)Sorvall RC 5C Plus 冷冻离心机： Kendro Laboratory Products；f)JY92-II 超声细胞粉碎机：上海新芝生物技术研究所；g)SHB-88 循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；h)0.22 微米一次性无菌滤器。其他常规仪器：电子分析天平；电磁搅拌器；烧杯；微量移液器； 50ml

21、 离心管； 次性使用无菌注射器滴管；玻璃棒。 试剂 a)50 mM Tris-HCl pH 7.5每 100mlTris：1.212g ddH2O：95ml 用 HCl 调至 pH7.5 后，室温保存；北京大学校长基金论文集（ 2003 年）利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象b） 100mM PMSF （剧毒 ）：每 15mlPMSF：261mg异丙醇： 15ml 溶解后分装 750l/管， 20oC 保存；c） 1M DTT （储液）： 每 100mlDTT ：1.55mg ddH2O：10ml， 20oC 保存；d） 200mM PBS 缓冲液（ 5 倍储液） pH6.9 每 1LNa

22、2HPO4 100mM ：358.14g；NaH2PO4 100mM ：156.01g；e） Buffer A：40mM PBS 缓冲液 将储液 d）稀释 5 倍； 0.45m 滤膜过滤；f） Buffer B ：每 1L储液 d）：200ml；NaCl： 58.44g （1M ）； ddH2O ：配至总体积为 1L ； 0.45m 滤膜过滤；g） Buffer C：每 1L储液 d）：200ml；（NH4）2SO4： 201.18（1.5M）； ddH2O： 配至总体积 1L； 0.22m 滤膜过滤；h） Buffer D ：每 1L 储液 d）200ml； NaCl： 5.844g （ 0

23、.1M）； ddH2O： 配至总体积 1L；0.45m 滤膜过滤；i）蔗糖；固体，分析纯；北京大学校长基金论文集（ 2003 年）利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象j） （NH 4）2SO4：固体，分析纯；3实验步骤3.1 破壁（机械法）：1）配制破壁用缓冲液：每 3g 菌50 mM Tris-HCl ： 15ml；100mM PMSF ：150l；蔗糖： 3g； 1M DTT ：60 l；2）破壁： 将收获的菌体用破壁缓冲液重悬，冰水浴中，以 3秒脉冲（ 3 秒开， 3秒关） 超声破壁 120 次，超声功率为 400W，至混合液呈半透明。注：破壁后的溶液要马上进行下一步提纯，因为破壁后的

24、溶液里含有蛋白酶会降解蛋白3）离心：将破壁后的液体于 4， 24000g下离心 20min，上清液 0.22 滤膜过滤3.2 色谱法分离 （均以 1L 培养液所得约 3g 菌体为例）：1）离子交换色谱：a） 将蛋白样品用 0.22m 滤膜过滤；b） 以 Buffer A 为 A 泵溶液， Buffer B 为 B 泵溶液，采用 5ml Hitrap Q 柱，取蛋 白溶液每次 5ml 进行分离。用 A 泵上样，用 buffer A 冲平。洗脱为 30%B-60%B， 在 30%B-60%B 收集。收集样品后加入 （NH4）2SO4 至 1.5M。2）疏水层析疏水柱 Hi PREP Octyl F

25、F，依次以 1M NaOH, dd 水， buffer C 充分平衡；上一步 样品 0.22m滤膜过滤后用 B 泵上样，在用 buffer C冲平。洗脱为 100%C-0%C， 在 60%C-25%C 收集，洗脱峰约为 47%C。收集溶液超滤浓缩小于 2ml。3）凝胶过滤色谱凝胶过滤柱为 Superose S200。用 2ml loop ，一次上样 2ml。收集方式为峰收集， 50mAu 时停止收集。一次收集 1.5ml ，最后收集的样品应舍弃第一管。3.3保存用 millipore Ultra free 15 超滤管浓缩， 1：1 加入已经灭菌的 80%甘油， -20 保存。MjHSP16.

26、5 浓度的测定北京大学校长基金论文集( 2003 年)1. 原理利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象蛋白质通常在波长 280nm处，有最大吸收峰，因此可以利用紫外可见分光光度计，测 出一定浓度蛋白溶液在该波长下的吸收。 再根据蛋白浓度和吸收强度成正比的定理， 利用 该蛋白的吸光系数，求出溶液中蛋白的浓度。据文献报道 MjHSP16.5 在 280nm 处的吸光系数为 0.565(mg/ml)-1cm-1，使用光程 1cm 的吸收池，故可利用公式计算蛋白浓度。蛋白浓度 =280nm 处紫外吸收值 / (吸光系数光程长)=280nm 处紫外吸收值 / 0.5652. 仪器和试剂 仪器 a) La

27、mbda 45 UV/Vis Spectrometer: PerkinElmer Instrumentsb)微量光吸收池(光程 1cm，样品量 50 l )：PerkinElmer Instruments 试剂 Buffer: 视情况而定，应与蛋白溶液除去蛋白后的组成完全相同3.实验步骤：a) 将两吸收池洗净吹干，分别用作样品池和参比池，在 280nm波长下自动调零；b) 估计蛋白溶液浓度， 取少量将其用 Buffer 稀释至约 0.5mg/m(l 即吸光度约 0.2-0.4 为宜)；c)取蛋白溶液 100l 于样品池， Buffer 100 l 于参比池，测定蛋白溶液在 280nm 处的吸收

28、；d)计算蛋白浓度。四、丙稀酰胺对 Trp 的荧光淬灭1 原理 荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现 象称为荧光淬灭。能引起荧光强度降低的物质称为淬灭剂。一种研究蛋白构象非 常有用的试验方法是将淬灭剂加入溶剂中。有三种常用的 淬灭剂：丙稀酰胺，I -,Cs+。其中丙稀酰胺是中性分子， 而后两种分别带负电和正电。 淬灭剂的浓度变 化从 0.01M到 0.5M。对于蛋白来讲，丙稀酰胺被广泛的应用到确定 Trp 残基的暴 露度。此试验是在每一温度下用丙稀酰胺进行滴定，记录荧光信号以获得淬灭数 据。这一过程可以描述如下：M(S1) + Q M(S0) + Qk qQ(1)

29、无淬灭剂时，0FkR (2)F kR k010北京大学校长基金论文集( 2003 年)利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象有淬灭剂存在时，kR k0 k QQ(3)所以，0FkR k0 kQQFkR k0(4)其中 k0 kNR kISC kPR因为无淬灭时单重态寿命为 s 1/(kR k0 ) 所以， (4) 式可以简化为：0F 1 kQ SQ(5)F以上就是著名的 Stern-Volmer 等式。令KV kQ S，KV 值可以表示 Trp残基在溶剂中的暴露程度， 高的KV 值可以说明残基暴露于溶剂中，低的 KV 值则说明残基被包含在蛋白中。2仪器和试剂 ：a) 色谱纯丙稀酰胺溶液( 5M

30、 )；b) 纯化后的小热休克蛋白溶液；c)1-cm quartz fluorescence cuvette；s3步骤与方法 ：a) 2.00ml 蛋白溶液样品，使其浓度大约为紫外吸收在 EX 0.05 。b) 记录蛋白和空白的荧光光谱：荧光的激发波长为295nm，记录发射光谱从310nm 到 450nm。c)分别加入丙稀酰胺溶液 5，5，10，20，20，20，20，20， 40，40 l 使最后丙稀酰胺的浓度大约在 0.5M。d)按照上述步骤测量空白的荧光光谱。e)重复上述步骤，控制温度从 25到 95，每隔 5测量一次。4.数据处理 ：将 b)中测得的荧光强度减掉相应的 c )中的空白值，

31、 初始荧光强度为 F0, 在荧光淬灭剂浓 度Q时荧光强度为 F。F0/F 对Q 作图，数据用 SAS线性拟合，拟合直线强制过( 0,1) 点，获得 KV 值。将不同温度下获得的 KV 对温度作图。5.试验结果：a) 各个温度下 Stern-Volmer 等式的线性拟合：2511北京大学校长基金论文集（ 2003 年）利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象4530354012505560北京大学校长基金论文集（ 2003 年） 利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象8570809013T/Kv2514.80423016.00273521.02954022.06454518.24335020.51

32、795521.54036024.2997北京大学校长基金论文集( 2003 年) 利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象6522.56877024.08888027.79308528.78659030.08239533.5938注释：以上图中纵坐标 F1 为(F 0/F)-1 ， 横坐标为丙稀酰胺浓度 Q第三章 结果讨论从以上图形可以看出， KV随温度变化有较为明显的上升趋势， 由于KV 值大小体现了 Trp残基在溶剂中的暴露程度， 所以KV值的上升可能说明 Trp残基随温度的上升， 其在溶 剂中暴露的越多。致谢感谢来鲁华老师和曹敖能老师在一年多的时间里给予我的指导和关心。从他们身 上，我不仅学到了生物化学领域的知识，更重要的是作为一个科学工作者的研究方法和 治学态度。这些注定将让我受用终身。感谢蔡利峰博士和王铮研究生给予我的帮助， 是他们一开始将我领进这个我相对陌 生的领域。感谢范可强、魏平两位师兄平时对我学习上的帮助和支持。感谢徐菲、杨铭两位同学平时对我生活上的照顾与帮助。最后，感谢我的家人在我实验和学习期间给