2核酸操作技术-DNA提取

1、第二章、基因工程的基本技术介绍核酸操作技术：提取、电泳、杂交基因克隆技术：文库构建DNA测序技术基因表达研究技术聚合酶链反应（PCR）技术1、植物基因组DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测一、核酸操作技术一、核酸操作技术n脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA) n与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。n植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。背景知识背景知识核酸的存在形式核酸的存在形式n DNA为白

2、色类似石棉样的纤维状物，RNA的纯品呈白色粉末或结晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。 n DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。n 在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。 核酸的理化性质核酸的理化性质细胞破碎细胞破碎 抽提去蛋白质抽提去蛋白质 沉淀核酸沉淀核酸基本过程基本过程 机械方法：机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法：酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。 细胞破碎细胞破碎 uSDSSDS法法 SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间常借静

3、电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。uCTABCTAB法法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。DNADNA提取提取u 蛋白质蛋白质 常用 苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。u RNA RNA 常选用RNase消化 。u 酚类物质酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇；选取幼嫩的材料。u 多糖多糖 提取液中加1PVP。DNADNA纯化（去杂质）纯化（去杂质）实验材料实验材料 新鲜蔬菜叶片(去叶脉)试剂试剂 2CTAB抽提液 TE 缓冲液(pH=8.0) 氯仿：异戊醇(

4、24:1) 材料与试剂材料与试剂离心机 水浴锅研钵 微量移液器仪器用具仪器用具移液器量程的选择移液器量程的选择1取取 2g 清洗晾干的新鲜叶片于研钵中，加清洗晾干的新鲜叶片于研钵中，加 1/3 药匙石英砂药匙石英砂和和 4mL 2 倍的倍的 CTAB 提取液，迅速研磨。提取液，迅速研磨。破碎细胞破碎细胞2将将 1mL 研磨液转入研磨液转入 1.5mL 离心管中，置于离心管中，置于65水浴中保水浴中保温温 20min，其间颠倒混匀，其间颠倒混匀23次。次。核酸和蛋白质分离核酸和蛋白质分离3. 12000r/min 离心离心 5min，取上清液，取上清液700L转到另一离心管转到另一离心管中。加入

5、等体积氯仿：异戊醇（中。加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒）混合液，充分颠倒混匀。混匀。12000r/min，离心，离心 5min。抽提去蛋白抽提去蛋白4将上清液移入新的将上清液移入新的1.5mL离心管内，加离心管内，加 600L异丙醇。颠异丙醇。颠倒混匀，可见倒混匀，可见 DNA 白色絮状沉淀。白色絮状沉淀。沉淀核酸沉淀核酸512000r/min，离心，离心 1min，倒掉上清液，将离心管倒置干，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。燥。 将沉淀回溶于将沉淀回溶于20L TE 缓冲液待测。缓冲液待测。溶解核酸溶解核酸操作步骤操作步骤1)1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与

6、 CTAB 抽提液充分混匀；2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（25）；尽可能选取幼嫩的材料；3）收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难；4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。注意事项注意事项 DNADNA分子在高于分子在高于等电点的等电点的PHPH溶液中溶液中带负电荷，在电场带负电荷，在电场中向正极移动。中向正极移动。 在一定电场强度在一定电场强度下，下，DNADNA分子的迁移分子的迁移速度与相对分子质速度与相对分子质量的对数成

7、反比。量的对数成反比。电泳原理电泳原理琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。仪器和试剂仪器和试剂 仪器仪器 电泳仪电泳仪 电泳槽电泳槽 灌胶模具等灌胶模具等Tris-硼酸（硼酸（TBE） Tris-乙酸（乙酸（TAE） Tris-磷酸（磷酸（TPE）常用电泳缓冲液常用电泳缓冲液 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400400组成上组成上样缓冲液。样缓冲液。 作用：作用：增加样品比重，以确保增加样品比重，以确保DN

8、ADNA均匀沉入加样孔内。均匀沉入加样孔内。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。使样品呈色，使加样操作更方便。使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液上样缓冲液溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）是一种荧光染料，是一种荧光染料，EBEB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNADNA的含的含量成正比。据此可粗略估计样品量成正比。据此可粗略估计样品DNADNA浓度。浓度。 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶EBEB染色，肉眼可见核酸电泳带，其染色

9、，肉眼可见核酸电泳带，其DNADNA量一般量一般5ng5ng。核酸染色剂核酸染色剂注意事项：注意事项：EBEB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。DNADNA分子量标准分子量标准不同种类不同种类DNA Marker1.1.凝胶制备凝胶制备 制备制备0.8%0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入入 20mL 0.520mL 0.5TBETBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60 50-60 时，加入时，加入 EB EB 至终浓度至终浓度 0.50.5g/mLg/mL。缓慢倒入。缓慢倒入胶

10、板，待胶凝固后拔出梳子。胶板，待胶凝固后拔出梳子。2.2.加样加样 取取1010l DNAl DNA样液与样液与 2 2l l 上样上样 buffeer buffeer 混匀，混匀，用微量移液器小心加入样品槽。用微量移液器小心加入样品槽。3.3.电泳电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为为15V/cm15V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）（长度以两个电极之间的距离计算）, ,待溴酚待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。兰移动到一定位置，停止电泳。4.4.观察拍照观察拍照电泳操作步骤1.1.结合原理，简述结合原理，简述CTABCTAB法分离法分

11、离提取植物总提取植物总DNADNA的基本过程。的基本过程。2.2.为了获得高质量的植物总为了获得高质量的植物总DNADNA，在分离提取过程中应注意那在分离提取过程中应注意那些问题？些问题？What?!How?!思考思考2 2、动物基因组、动物基因组DNADNA、总、总RNARNA提取提取理论基础理论基础l核酸核酸是遗传信息的携带者，是生命的最基本物质，它和是遗传信息的携带者，是生命的最基本物质，它和蛋白质是构成生物体的主要成分；蛋白质是构成生物体的主要成分；l按化学组成可以将核酸分成两大类：按化学组成可以将核酸分成两大类： 含脱氧核糖核酸（含脱氧核糖核酸（DNA），），主要主要存在于细胞核中；

12、存在于细胞核中； 含核糖核酸（含核糖核酸（RNA），），主要主要存在于细胞质内；存在于细胞质内； 在生物体中核酸以结合成在生物体中核酸以结合成核蛋白核蛋白的形式存在，但核的形式存在，但核酸极不稳定，在较剧烈的物理、化学因素和酶的作用下酸极不稳定，在较剧烈的物理、化学因素和酶的作用下都很易降解。都很易降解。核酸分离、纯化原则核酸分离、纯化原则l 保持核酸分子一级结构的完整性保持核酸分子一级结构的完整性 意义：意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式决定其高级结构的形式以及和其他生物大分

13、子结合的方式。l 排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 ；l 无杂核酸分子的污染（如纯化无杂核酸分子的污染（如纯化DNA分子时应分子时应 去除去除RNA分子）。分子）。注意注意事项事项：l在低温下进行操作；在低温下进行操作；l减少物理因素对核酸的减少物理因素对核酸的机械剪切力机械剪切力；l防止过酸、过碱引起核酸降解，控制防止过酸、过碱引起核酸降解，控制pH值范围（值范围（pH值值5-9），并要保持一定离子强度；），并要保持一定离子强度；l防止核酸的生物降解；防止核酸的生物降解； 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯细胞内或外来的各种核酸酶能消

14、化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。因此，所用器械和一些试剂需键，破坏核酸一级结构。因此，所用器械和一些试剂需高温高温灭菌灭菌，提取缓冲液中需加，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂核酸酶抑制剂。 进行核酸分离时最好进行核酸分离时最好新鲜新鲜生物组织或细胞样品，若不生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70冰箱中。冰箱中。2.1、DNA的提取的提取l在动植物中，小牛胸腺、动物肝脏、鱼类精子，植在动植物中，小牛胸腺、动物肝脏、鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的物种子的胚中都含有丰富的DNA；l微生物中，面包酵母含微生物中，面包酵母含

15、4%，啤酒酵母含，啤酒酵母含6%，大肠，大肠肝菌含肝菌含9%10%。l原理原理：将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（烷基硫酸钠（SDS）溶液，使）溶液，使DNA与蛋白质分离开。与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使其浓度达到加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/L，使，使DNA溶解。溶解。加氯仿加氯仿-异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯纯DNA。最后用。最后用95%乙醇沉淀乙醇沉淀DNA。去除蛋白的常用方法去除蛋白的常用方法l变性剂法：变性剂法：用用SDS等去污剂使蛋白质变性，可以直接从等去污剂使蛋白质变性

16、，可以直接从生物材料中提取生物材料中提取DNA；l苯酚法：苯酚法：用含水的酚溶液沉淀蛋白质和用含水的酚溶液沉淀蛋白质和DNA，分层、离，分层、离心。因蛋白变性，抑制了核酸酶活性，并且操作过程比较心。因蛋白变性，抑制了核酸酶活性，并且操作过程比较缓和，可以得到较好的缓和，可以得到较好的DNA制品；制品；l氯仿法：氯仿法：用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化，用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化，离心除蛋白，离心除蛋白，DNA在上层水相，用乙醇沉淀上层，可将在上层水相，用乙醇沉淀上层，可将DNA沉淀出来。沉淀出来。DNA的提取的提取过程过程l溶解：溶解：将离心后除去将离心后除去RNA的沉淀

17、，用的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加浆一次。加4毫升毫升10SDS溶液溶液，使溶液的，使溶液的SDS浓度达到浓度达到1左右，边加边左右，边加边搅拌，放置搅拌，放置60 水浴保温水浴保温10分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到溶液氯化钠浓度达到1mol/L，充分搅拌，充分搅拌10分钟；分钟；l除杂质：除杂质：加等体积加等体积氯仿氯仿-异戊醇异戊醇混合液，充分震荡混合液，充分震荡10分钟分钟， 8000 r/min离心离心7分钟，取分钟，取上层上层液量好体积，倒入烧杯中（液量好体积，倒

18、入烧杯中（离心管离心管），加同体积的氯仿），加同体积的氯仿-异异戊醇混合液，戊醇混合液，重复上次操作重复上次操作。直至界面不出现蛋白凝胶为止；。直至界面不出现蛋白凝胶为止；l沉淀：沉淀：准确量取上清液体积，加准确量取上清液体积，加2倍体积倍体积95冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却冷却，待有白色丝状物出现，约，待有白色丝状物出现，约10-15分钟分钟，离心，离心8000 r/min离心离心7分钟，分钟，得白色沉淀；得白色沉淀；l溶解：溶解：将沉淀物用将沉淀物用0.1mol/L NaOH约约10毫升溶解。毫升溶解。2.2、RNA的提取的提取lRNA广泛存在啤酒酵母，面包酵母

19、，酒精酵母和各种动物组织中广泛存在啤酒酵母，面包酵母，酒精酵母和各种动物组织中。l常见方法（依据常见方法（依据RNA的种类和来源）：的种类和来源）： 苯酚法（实验室最常用的方法）苯酚法（实验室最常用的方法） 去污剂法、去污剂法、盐酸胍法，盐酸胍法，l苯酚法：苯酚法：组织匀浆后用苯酚处理离心，组织匀浆后用苯酚处理离心，RNA即即溶于上层溶于上层被苯酚饱和的水相中，被苯酚饱和的水相中， DNA和蛋白质则留在苯酚层中，和蛋白质则留在苯酚层中，向水相加冷乙醇后，向水相加冷乙醇后， RNA即以白色絮状沉淀析出。即以白色絮状沉淀析出。优点：优点：较好除去较好除去DNA和蛋白质，且获得生物活性的和蛋白质，且

20、获得生物活性的RNA。l原理：原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于可溶于水或浓盐溶液（如水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在氯化钠），但在0.14mol/L氯化钠氯化钠盐盐溶液中溶解度溶液中溶解度最低最低，而核酸核蛋白，而核酸核蛋白（RNP）则在则在0.14mol/L氯氯化钠中溶解度化钠中溶解度最大最大，利用这一性质可将其分开。，利用这一性质可将其分开。l方法：方法：先用组织捣碎机将动物肝脏制成组织匀浆，再用先用组织捣碎机将动物肝脏制成组织匀浆，再用0.14mol/L 氯化钠溶液把细胞中的氯化钠溶液把细胞中的 RNP 提取出来，最后用酚提取出

21、来，最后用酚将将RNA和蛋白质分开和蛋白质分开。RNA提取提取原理及方法原理及方法RNA 提取提取步骤步骤l匀浆：匀浆：称取称取3克牛肝剪碎，加克牛肝剪碎，加20mL 0.14mol/L氯化钠溶液氯化钠溶液10000r/min左右左右匀浆匀浆1分钟左右；分钟左右；l离心：离心：匀浆后溶液离心匀浆后溶液离心8000 r/min离心离心7分钟，量取上清液分钟，量取上清液毫升数毫升数，沉淀物，沉淀物留做提取留做提取DNA；l除杂质：除杂质：于上清液中加入等体积于上清液中加入等体积80苯酚苯酚溶液，搅拌充分混合溶液，搅拌充分混合10-15分钟，分钟，置冰箱置冰箱冷却冷却静止静止10-15分钟，离心取含

22、有分钟，离心取含有RNA上层水相，弃下层酚相；上层水相，弃下层酚相；l沉淀沉淀RNA：取上层水相含取上层水相含RNA溶液，加入溶液，加入2倍体积倍体积95冷乙醇，搅拌，充冷乙醇，搅拌，充分混合，置冰箱中冷却分混合，置冰箱中冷却(约约10-15分钟分钟)，至出现白色絮状物，至出现白色絮状物RNA，离心，离心8000 r/min离心离心7分钟，取沉淀物；分钟，取沉淀物；l溶解：溶解：用少量去离子水（约用少量去离子水（约20毫升）溶解沉淀物，用以测定其含量。毫升）溶解沉淀物，用以测定其含量。工工 艺艺 图图3g肝脏肝脏 + 20mL0.14mol/L 氯化钠氯化钠 匀浆匀浆, 1min 离心离心 8

23、000r/min, 7min 等体积等体积80苯酚苯酚搅拌搅拌10-20min，冰箱静置，冰箱静置30min8000rn/min，7min上清上清RNA、多糖、多糖沉淀沉淀DNA、蛋白、蛋白加加2 2倍体积倍体积9595冷乙醇冷乙醇冰箱至出现白色沉淀冰箱至出现白色沉淀离心离心沉沉 淀淀离心离心冰箱至出现白色沉淀冰箱至出现白色沉淀加加2倍体积倍体积95冷乙醇冷乙醇等体积氯仿等体积氯仿/异戊醇，震荡异戊醇，震荡10min/离心离心加氯化钠至加氯化钠至1mol/L，搅拌，搅拌10min4ml 10SDS，60，10min30ml生理盐水溶解生理盐水溶解上上 清清DNARNA3、质粒DNA的分离、纯化

24、及检测pUC192686 bpAPrALPHAP(BLA)P(LAC)ORIAvaI (413)BamHI (418)EcoRI (397)HindIII (448)PstI (440)SmaI (415)XmaI (413)ApaLI (178)ApaLI (1121)ApaLI (2367)n质粒是染色体外的DNA分子，大小从1kb-200kb。n大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。n细菌内的共生型遗传因子。n其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。一、分离纯化原理 碱法提取主要是利用共价、闭合、环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓

25、扑学上的差异来分离它们。在碱性PH下DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。碱性下，变性蛋白是可溶的；酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA。 要去除的物质： 蛋白质； 染色体（基因组）DNA； 脂类及小分子杂质； RNA。 二、实验仪器、材料与试剂 （一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pUC19质粒的大肠杆菌、LB液体培养基（三）试剂： 溶液I（ 50mM 葡萄糖；25mM TrisHCl（pH8.

26、0）；10mM EDTA ）； 作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活。溶液II（ （新鲜配制）0.2N NaOH；1% SDS ）作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液III（ 5M KAC 10ml；冰醋酸 11.5ml；水 28.5ml ） 作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白SDS线性DNA沉淀。平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA1、取1.

27、5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4下12000g离心30秒。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于100l溶液中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。 4、加入新配制的溶液200l, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。 5、加入150l预冷的溶液,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4下12000g离心5-10分钟。 6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4下12000g离心5分钟。 7、将水相移入干

28、净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20冰箱中20分钟，然后4下12000g离心10分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70乙醇洗沉淀一次,4下12000g离心5-10分钟。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。 10、将沉淀溶于20l TE缓冲液(pH8.0，含20g /ml RNaseA)中，储于-20冰箱中。 三、操作步骤三、操作步骤 菌体老化菌体老化碱裂解不充分碱裂解不充分菌体中无质粒菌体中无质粒溶液使用不当溶液使用不当涂布平板培养后，重新挑选涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培

29、养新菌落进行液体培养可减少菌体用量或增加溶液可减少菌体用量或增加溶液的用量的用量不要频繁转接，每次接种时不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。使用浓度是否正确。溶液溶液在温度较低时可能出在温度较低时可能出现浑浊，置于现浑浊，置于3737保温片刻保温片刻直至溶解为清亮的溶液直至溶解为清亮的溶液。四四、质粒、质粒DNADNA提取常见问题提取常见问题q问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 原原因因对对策策混有蛋白混有蛋白混有混有RNARNA混有基因组混有基因组DNADNA不要使用过多菌体。重新纯化

30、不要使用过多菌体。重新纯化DNADNA，去除蛋白、多糖、多酚，去除蛋白、多糖、多酚等杂质等杂质加入加入RNaseARNaseA室温放置一段时间室温放置一段时间加入溶液加入溶液II II 和和IIIIII后防止剧烈振荡，后防止剧烈振荡，可能把基因组可能把基因组DNADNA剪切成碎片剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和时间过长会导致细胞和DNADNA的的降解，培养时间不要超过降解，培养时间不要超过1616小小时。时。五、质粒五、质粒DNADNA提取常见问题提取常见问题q问题二：质粒纯度不高，如何解决？问题二：质粒纯度不高，如何解决？ 原原因因对对策策1

31、. 简要叙述溶液、溶液和溶液的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。2. 染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？六、问题与讨论琼脂糖凝胶电泳技术一、琼脂糖凝胶电泳的功能 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 二、实验原理： 在 pH 值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电

32、，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段，检测核酸分子量大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 三、琼脂糖电泳分离DNA的范围 琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。四、电泳指示剂： 核 酸 电 泳 常 用 的 指 示 剂 有 两 种 ， 溴 酚 蓝（ bromophenol blu

33、e, Bb ）呈蓝紫色；二甲苯晴（ xylene cyanol, Xc ）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。 五、影响凝胶电泳的因素 在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 1、DNA的分子大小: 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比。 2、琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。3、DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。4、电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率