(精编资料推荐)登革热检测规程.doc

1、登革热（一）登革病毒感染与机体免疫反应登革病毒感染后，潜伏期为314 天，通常 47 天，潜伏期内采集的患者标本尚不能检出登革病毒或相应的机体免疫反应。发病后，病毒在血液中存在的时间（病毒血症期）约为7天，病毒 NS1抗原在血液存在的时间略长。发病后4 5 天内，可在病人的血清、血浆、白细胞、脑脊液和尸检组织标本中分离到病毒，病毒核酸及NS1抗原在这个时期的检出率高。病人血液中抗体水平，因个体免疫状态不同而具有显著差异。若以前没有感染过登革病毒或其他黄病毒，或接种过黄病毒疫苗（如：乙脑、黄热等），病人首次感染抗体免疫反应呈现为特异性抗体水平缓慢升高， IgM 抗体出现最早，随后出现的是IgA

2、和 IgG 抗体。在发病后35 天的患者中IgM 抗体检出率约为50%，发病后第 5 天的患者中检出率约为80%，而在发病后第10 天患者中，约 99%的患者可检出。 IgM 抗体水平在发病后2 周达高峰，然后逐步下降，可保持23 个月。IgA 抗体出现略晚于IgM 抗体，可保持约45 天。在发病一周后，可在血液标本中检出较低滴度的 IgG 抗体，之后抗体滴度缓慢升高，可持续存在多月甚至终生。如果病人属于再次感染登革病毒（登革病毒感染者以前曾感染过登革病毒，有时可能是曾接种其他黄病毒疫苗或感染过其他黄病毒），抗体滴度可快速升高并可和多种黄病毒产生反应。主要为高水平的IgG 抗体，在急性期即可检

3、出，可持续存在10 个月以上，甚至终生。IgA 抗体也可在急性期标本中检出。再次感染登革病毒的病人恢复期早期的IgM 抗体滴度明显低于首次感染，甚至无法检出，通过计算 IgM/IgG 抗体比例，可以区分首次或再次登革病毒感染。IgA 抗体检测试剂在临床诊断中的应用尚处于评价阶段。1登革病毒 IgM/IgG 抗体检测规程【方法】胶体金法【预期用途】登革热（ Dengue Fever ）是 一种由登革病毒引起的急性传染病，主要流行于热带和亚热带国家和地区。登革病毒为单股正链RNA 病毒，在分类学上属于黄病毒科，黄病毒属（flavivirus ）。病毒核心为RNA 与蛋白质组成的 20 面立体对称的

4、病毒颗粒，外层为两种糖蛋白组成的包膜，包膜含有型和群特异性抗原。病毒基因编码3 个结构蛋白（核衣壳蛋白C，膜蛋白 M，包膜蛋白E）和 7 个非结构蛋白（ NS1,NS2a,NS2b,NS3,NS4a,NS4b,NS5 ）。登革病毒感染可导致机体产生免疫应答，并产生病毒特异性的抗体。初次感染者，发病后3 5 天可在血液中检出病毒IgM 抗体，发病2 周后达到高峰，可维持2 3 个月，发病 1 周后可检出病毒IgG 抗体， IgG 抗体可维持数年甚至终生。检测临床登革热症状的病人样本中登革病毒抗体，有助于登革热的辅助诊断。【检验原理 】采用胶体金免疫层析技术，在玻璃纤维上预包被胶体金标记的登革病毒

5、抗原（Au-Dengue-Ag）和羊IgG(Au- 羊 IgG) ，在硝酸纤维素膜上IgG 检测线， IgM 检测线和对照线处分别包被鼠抗人IgG 单克隆抗体，鼠抗人 IgM 单克隆抗体和鼠抗羊IgG 单克隆抗体。检测阳性标本时，样本中登革热病毒IgG 抗体（或IgM 抗体）与 Au-Dengue-Ag结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过IgG 检测线（或IgM 检测线）时与预包被的鼠抗人IgG 单抗（或鼠抗人IgM 单抗）形成“ Au-Dengue-Ag Dengue病毒抗体鼠抗人 IgG 单抗（或鼠抗人IgM 单抗）固相材料”夹心物而富集显色，胶体金标记羊IgG 则在对照

6、线与鼠抗羊IgG 单克隆抗体结合富集显色，阴性标本则仅在对照线处显色。【试剂组成成分 】1 ，登革病毒IgM/IgG抗体试剂检测线：鼠抗人IgM 抗体、鼠抗人IgG 抗体对照线：鼠抗羊IgG 抗体结合垫：胶体金标记登革病毒抗原和胶体金标记羊IgG2 ，梓品稀释液3 ， 2uL 吸管【样本要求 】1 ，检测样本为血清或血浆，避免溶血。2 ，血浆可用肝素、柠檬酸钠或EDTA 抗凝。3 ，采集后的标本及时检测，2 8C 密封保存7 天，长期保存需冷冻-20C ，忌反复冻融。【检验方法 】检测前先将冷藏的试剂和待测样本恢复至室温1 ，处理好样本，取出试剂检测卡，水平放置并作好标记。2 ，用移液器吸取样

7、本2uL，或以试剂配置吸管吸取样本至2uL 刻线，滴加在检测卡样本孔（S1 孔）。3 ，在检测卡稀释液孔（S 孔）滴加 2 滴（ 70-100uL ）样品稀释液。4 ，20 分钟同观察记录结果。2【结果报告 】阳性：质控线（ C）和检测线（G）、检测线（M ）都出现紫红色条带，表示样品中含有登革病毒IgM/IgG抗体。质控线（ C）和检测线（G）都出现紫红色条带，表示样品中含有登革病毒IgG 抗体。质控线（ C）和检测线（M ）都出现紫红色条带，表示样品中含有登革病毒IgM 抗体。阴性：仅在质控线（C）出现紫红色条带，检测区（M ）、检测区（ G）未出现紫红色条带，表示样品中没有登革病毒抗体或

8、抗体浓度低于试剂的检出水平。无效：质控线（ C）未出现紫红色条带，表示操作不当或者试剂失效，应重新检测。【报告方式 】检测线（ G）、检测线（ M ）都出现紫红色条带登革热病毒IgM/IgG抗体测定：IgM 阳性（ +） IgG 阳性（ +）【注意事项 】1 ，检测按照传染病实验管理规范和生物安全守则的规定操作，实验后按传染性废物处理。2 ，操作应严格按说明书进行。3 ，保持良好的实验室环境。4，严格控制在20 分钟内观察结果，20 分钟后观察结果无效。【传染性 废物处理】1 ，所有实验室工作人员应熟知并遵守本制度；由专职清洁人员负责实验废弃物处理。实验室放置装有垃圾袋的有盖污物桶，并贴有明显

9、标识。2 ，每天实验结束后，及时清理并妥善包裹废弃物，送出实验室并作好实验室废弃物处理记录。3 ，不具有传染性的实验室废弃物（如产品包装材料和废纸等办公垃圾），应与传染性废弃物区分开来，作为普通废弃物单独送医疗废物集中处理中心统一处理。4 ，血袋、装血液的试管、离心管、吸头等由科室洗涤人员用有效氯浓度0.3 的爱尔施消毒液充分浸泡（ 60 120 分钟），进行初步消毒处理。5 ，进行初步消毒处理的血袋、试管和与受血液污染的棉球、纸片、一次性口罩、帽子等传染性或可疑传染性废弃物一起放入黄色胶袋中，由废物集中处理中心无害化处理中心封闭运输至焚烧中心进行无害化焚烧处理。6 ，每天实验前，在清洗盆中加

10、入半盆有效氯浓度0.3 % 的爱尔施消毒液，实验中将玻片、离心管、吸管、吸头等回收物品充分浸泡（ 60 120 分钟），进行初步消毒处理。7 ，收集一天的污染物品用流动水冲洗，然后进行高压灭菌处理。3登革热 NS1 抗原检测规程【方法】胶体金法【预期用途】本试剂采用免疫层析技术，定性检测人血清、血浆或者全血中的登革热NS1 抗原。适用于登革病毒感染的早期辅助诊断和筛查。登革热是由登革病毒（分4 个血清型， DENV 1 4 ）引起的，通过伊蚊传播的急性传染病，多见于热带和亚热带地区。临床类型可分为登革热、登革热出血热和登革休克综合征三种，该病传播迅速，主要临床表现包括发热、头痛、全身肌肉关节疼

11、痛、极度乏力、皮疹、淋巴结肿大、白细胞减少。初次感染登革热病毒患者，一般临床表现较轻，可表现为无症状隐性感染，或轻型、典型登革热；再次感染异型登革病毒时，病情较为严重，临床上出现登革出血热和休克综合征的概率增加，病死率高，是一种具有严重危害性的传染病。【检验原理 】本试剂方法采用免疫层析法，应用双抗体夹心法定性检测登革热NS1 抗原。登革热NS1 抗原测试条的硝酸纤维素膜检测区（T）上包被有抗登革热病毒NS1 蛋白单克隆抗体，质控区（C）上包被有抗鼠IgG 多克隆抗体，当样本中含有登革病毒NS1 抗原且浓度高于最低检出限时，标记有胶体金的抗登革病毒NS1 蛋白单克隆抗体下血清、血浆或全血中的登

12、革病毒NS1 抗原结合形成反应复合物，在层析作用下复合物没着硝酸纤维素膜向前移动，与硝酸纤维素膜上检测区（T）预先包被的抗登革热NS1 抗原单克隆抗体结合形成复合物，并最终形成一条肉眼可见的红色反应线，此时的结果为阳性。相反，当样本中不含有登革病毒NS1 抗原且浓度低于最低检出限时，则检测区（T）无红色反应线出现，此时结果为阴性。无论样本中是否有NSI 抗原，在质控区（C）都会形成一条红色反应线。【主要组成成份 】试剂盒由测试卡和吸管组成。测试条由硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫、吸水纸、PVC 板等其他支持物组。硝酸纤维素膜包被有抗登革病毒 NS1 蛋白单克隆抗体和抗鼠 IgG 多克隆抗体，结合

13、垫含 有胶体金标记的抗登革病毒 NS1 蛋白单克隆抗体。【样本要求 】1 ，血清、血桨、全血样本均可用于测试。2 ，全血样本采集后尽可能立即使用，如不能立即检测可蒋样本放置于2-8C 冷藏，全血样本需在 3 天内完成检测。3 ，血清 / 血桨如不能及时测试应放置于2-8C 冷藏，可保存两周，如需长期保存应置-20C 冷冻保存，测试前注意恢复至室温。4 ，注意高浓度的黄疸样本、高度溶血样本、或肉眼可见多絮状沉积的乳糜血样本，将对检测结果的干扰，因此在使用样本前注意样本的外观。【检验方法 】4检测前先将冷藏的试剂和待测样本恢复至室温1，取出测试卡平放于台上，并做好标记2，有吸管吸取样本血清 / 血桨 / 全血样本，垂直加入2-3 滴（约 60-80uL）于加样孔中，3， 15-20 分钟观察显示结果， 30 分钟后显示结果无临床意义。【结果报告 】NS1 抗原阳性：两条红色线，即在检测区（T）及质控区（C）各出现一条红色线。NS1 抗原阳性：一条红色线，即在质控区（C）出现一条红色。无效：即在质控区（C）无红色反应线出现。此时建义重测。【检验方法局限性 】1 ，当测试样本中登革病毒NS1 抗原低于最低检出限或在感染的某个阶段不存在将