酶底物法(科立得)产品培训

1、1水中微生物检测的全球领导者水中微生物检测的全球领导者叶卫军叶卫军电话：电话：13929538576139295385762水中微生物检测水中微生物检测（新国标方法）（新国标方法） 总大肠菌群/大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群 固定底物技术酶底物法介绍 3总大肠菌群总大肠菌群 / / 大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌 及耐热及耐热( (粪粪) )大肠菌群大肠菌群固定底物技术酶底物法固定底物技术酶底物法4微生物检测的重要性微生物检测的重要性地震等自然灾害过后水体中会被大量微生物所污染，特别是粪便污染，如水体中含有肠道病原菌株，并被人饮用则会爆发严重疾病如泌尿系感染、菌血症和脑膜炎，少数肠道病原菌株可引起急性腹

2、泻。通常人们用投放含氯消毒剂进行消毒，但消毒效果如何还需要通过检测水体中是否含有总大肠菌群和大肠埃希氏菌来判断。5指示菌的方法学定义指示菌的方法学定义l总大肠菌群（总大肠菌群（total coliforms) 大肠菌群系指一群在37培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，具有指标菌的一般特征故以此作为粪便污染指标评价饮水的卫生质量。l耐热大肠菌群耐热大肠菌群(thermotolerant coliforms) ，原名：粪大肠菌群（，原名：粪大肠菌群（fecal coliforms ) 用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大

3、肠菌群区分开，在44.5仍能生长的大肠菌群，称为粪大肠菌群。是水体受人畜粪便污染的比较直接指标。l大肠埃希氏菌（大肠杆菌，大肠埃希氏菌（大肠杆菌，e.coli.) 大肠埃希氏菌是指能产生-半乳糖苷酶（-d-galactosidase）分解onpg（ortho-nitrophenyl-d-galactopyranoside）使培养液呈黄色，能产生-葡萄糖醛酸酶（-glucuronidase）分解mug（4-methyl-umbelliferyl-d-glucuronide）使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的细菌。大肠埃希氏菌是粪大肠菌群的组成部分，是水体受人畜粪便污染的最直接指标，水中含

4、有大肠埃希氏菌提示有粪便污染。 6背景知识背景知识大肠菌群，耐热大肠菌群，大肠埃希氏菌 耐热大肠菌群大肠埃希氏菌大肠菌群7目前的粪大肠菌群检测方法是实际上是检测耐热大肠菌群而不是大肠埃目前的粪大肠菌群检测方法是实际上是检测耐热大肠菌群而不是大肠埃希氏菌。希氏菌。有关文献报道的试验结果表明有关文献报道的试验结果表明, 有有15%的阳性耐热粪大肠菌群实际上属于的阳性耐热粪大肠菌群实际上属于总大肠菌群而不是大肠埃希氏菌。这种情况的发生多数是由于耐热的克总大肠菌群而不是大肠埃希氏菌。这种情况的发生多数是由于耐热的克雷伯氏菌普遍存在于自然环境中，而非来源于人畜粪便，因此与人类疾雷伯氏菌普遍存在于自然环境

5、中，而非来源于人畜粪便，因此与人类疾病的产生也没有绝对的关联。病的产生也没有绝对的关联。同时，（用上述方法检测）会有同时，（用上述方法检测）会有10%的假阴性结果，是因为大肠埃希氏的假阴性结果，是因为大肠埃希氏菌属有菌属有10不会产气（注不会产气（注1）。）。注注1：目前的粪大肠菌群检测方法，产酸产气是预试验的阳性判断指标。：目前的粪大肠菌群检测方法，产酸产气是预试验的阳性判断指标。8粪便污染指示菌比较粪便污染指示菌比较 总大肠菌群总大肠菌群耐热耐热( (粪粪) )大肠菌群大肠菌群大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌肠球菌肠球菌亚硫酸盐还原菌亚硫酸盐还原菌 包含包含菌属菌属埃 希 氏 菌 属 、 柠 檬

6、酸 菌 属 、 克 雷 伯 菌 属 、 肠 杆 菌 属 （ 也 包 括 沙 雷 菌 属 和 哈 夫 尼 亚 菌属） 主 要 是 埃 希 氏 菌 属 和 耐 热 克 雷 伯 菌 属 大肠埃希氏菌 粪肠球菌、屎肠 球菌、耐久肠球 菌和海氏肠球菌 等 亚硫酸盐还原菌 来来源源可 来 自 人 畜 粪 便 ， 环 境 中 自 然 存在 主 要 来 自 于 温 血 动 物 粪 便 ， 也 可 来 自环境 主要来自温血 动物和人的粪 便 主要来自温血动 物和人的粪便 主要来自温血动 物和人的粪便 作为粪作为粪便污染便污染指示菌指示菌的意义的意义 水处理的指示菌 ,不能作为消毒效果的指示菌 比较直接的指示菌

7、指示粪便污染 的 最 理 想 指 标、作为消毒 效果的指示菌 用于输配水系统 维修后或新输配 水管线铺设后水 质的检测、用于 饮用水中大肠杆 菌检测有争议的 粪致病菌指标 为间歇性粪便污 染的指标、过滤 效果评价的指标 9我国水质微生物指标我国水质微生物指标(细菌细菌) 标准标准指标菌指标菌检测量检测量gb5749-2006,生活饮用水标准菌落总数,总大肠菌群, 大肠埃希氏或菌耐热大肠菌菌落总数:1ml;大肠菌100mlcj/t2062005城市供水水质标准细菌总数, 总大肠菌群、耐热大肠菌细菌总数1ml,总大肠菌群/耐热大肠菌群:100mlgb3838-2002,地表水环境质量标准粪(耐热)

8、大肠菌群1lgb/t 14848-93地下水质量标准gb 9667-1996,游泳场所卫生标准细菌总数、总大肠菌群细菌总数 1ml;总大肠菌群1l10检测方法检测方法 多管发酵法多管发酵法（multiple tube fermentation, mtf) 滤膜法滤膜法（membrane filtration, mf ) 固定底物技术酶底物法固定底物技术酶底物法(defined substrate technology, dst) 酶底物法酶底物法( enzyme substrate test, est) 11检测方法检测方法 多管发酵法多管发酵法（mtf）共需3-5天时间以100ml水样中大肠

9、菌最可能数(most probable number, mpn)表示 培养基制备试管培养（2226小时） 阴性结果（无产酸，产气） 产酸，产气 平板培养1824小时 革兰氏染色，镜检 观察菌落形态，挑取特征菌落 证实试验（培养242h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在 ）12检测方法检测方法 滤膜法滤膜法（membrane filtration,mf ) 共需2-3天时间用孔径为0.45的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数 ,计数单位为菌落形成单位cfu(colony forming unit)储备培养基的制备过滤

10、（需器械灭菌等）培养（22-24h） 阴性结果(无典型菌落） 革兰氏染色 镜检 观察菌落形态,挑取特征菌落 证实试验（培养242h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在） 13酶底物法酶底物法总大肠菌群总大肠菌群 阳性反应原理阳性反应原理-半乳糖醛苷半乳糖醛苷-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 14酶底物法酶底物法大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌阳性反应原理阳性反应原理-葡萄糖醛酸酶葡萄糖醛酸酶4-甲基甲基-伞形葡萄糖苷酸伞形葡萄糖苷酸151, 1, 方法方法本标准方法采用本标准方法采用固定底物技术固定底物技术酶底物法酶底物法defined substrate technology, dst2 2，培养基培养基：

11、采用采用m minimal inimal m medium edium o onpg-npg-mugmug，简称简称 mmo-mugmmo-mug培养基培养基3, 3, 优点优点 假阳性假阳性, ,假阴性底假阴性底 操作简单操作简单, ,快速快速 定性定性, ,定量（定量（5151孔孔/97/97孔定量盘法）孔定量盘法） 5050多个国家和组织认证多个国家和组织认证世界卫生组织世界卫生组织who, ,美国美国epa,epa,水与废水标准检验法水与废水标准检验法. .生活饮用水标准检验方法生活饮用水标准检验方法对酶底物法定义对酶底物法定义16科立得科立得 应用应用 饮用水饮用水 源水源水 瓶装水

12、瓶装水 再生水再生水 废水废水 食品水食品水 畜牧用水畜牧用水 医疗用水医疗用水 收录于收录于“标准测试法标准测试法”内内 apha(美国公共卫生协会美国公共卫生协会), us epa, aoac, us ncims, uk dwi , ibwa ,who 17假阳性比较：假阳性比较： vsvs 滤膜法滤膜法us epa1989lewis &mak 1989fricker et al1995colilertmf0%10%20%30%40%50%60%colilertmf18假阳性比较：假阳性比较：vsvs 滤膜法滤膜法* jacobs et al, aem,1986. * fricker et

13、 al, water res., 1997报告者：英国泰晤士水务报告者：英国泰晤士水务样品来源：泰晤士河，样品数样品来源：泰晤士河，样品数450个个19假阳性比较假阳性比较 vs 滤膜法滤膜法* jacobs et al, aem,1986. * fricker et al, water res., 1997 产生的原因产生的原因传统方法培养基非选择性,会产生相似结果引起假阳性反应培养基污染样品交叉污染操作误差 结论结论 试验证明可以用colilert取代滤膜法进行大肠菌群和大肠埃希氏菌，还证明了colilertdst酶底物法是不受化学、外力等外界因素变化而变化的。20假阴性比较：假阴性比较：

14、 vsvs 滤膜法及多管法滤膜法及多管法* jacobs et al, aem,1986. * fricker et al, water res., 1997假阴性率产生的原因假阴性率产生的原因由于是非特异培养基所以会有杂菌干扰清洁剂、盐、 抗生素、毒素、温度等原因会造成抑制反应 非发酵大肠菌膜过滤法的问题 过滤膜的损坏m-endo mf*mtf*mlsb mf*colilert*0%5%10%15%20%25%30%35%40%*jacobs et al, aem,1986. * fricker et al, water res., 199721实验步骤：实验步骤：colilert 对比对比

15、滤滤 膜膜 法法滤膜法 72步科立得:5步 22实验步骤：实验步骤：97孔定量盘法孔定量盘法 vs 多管发酵多管发酵23测试时间比较表测试时间比较表24经济成本分析经济成本分析传统方法科立得固定设备无菌室、显微镜、抽滤设备等封口机、紫外灯耗材滤膜、平皿、试管、总大肠菌群的培养基、大肠埃希氏菌培养基科立得、定量盘效率和人力2-3人，3-5天1人，1天25定性检测操作示范定性检测操作示范 2步法步法加入科立得试剂，加入科立得试剂，摇晃至溶解摇晃至溶解 3 36c6c培养培养2424小时，判断结果小时，判断结果: :1,1,无颜色变化阴性无颜色变化阴性 2, 2,黄色总大肠菌群阳性黄色总大肠菌群阳性

16、 3 3，黄色且荧光大肠埃希氏菌阳性，黄色且荧光大肠埃希氏菌阳性44.5 44.5 培养培养2424小时小时, ,判断结果：判断结果：1 1、无颜色变化阴性、无颜色变化阴性 2 2、黄色粪大肠菌群阳性、黄色粪大肠菌群阳性26定量检测（定量检测（51孔定量盘）孔定量盘） 5步法步法加入科立得试剂后，加入科立得试剂后，摇晃至溶解摇晃至溶解 将将colilertcolilert溶液倒入溶液倒入5151孔（或孔（或9797孔）定量盘孔）定量盘quanti-tray内内27将定量盘将定量盘quanti-tray放入放入程控定量封口机程控定量封口机sealersealer封口封口3 36 6 或或44.5

17、 44.5 培养培养2424后，计算呈阳性后，计算呈阳性反应的格子，然后对照反应的格子，然后对照mpnmpn表表 计数计数定量检测（定量检测（51孔定量盘）孔定量盘） 5步法步法28固定底物技术酶底物法固定底物技术酶底物法 科立得科立得所需试剂及设备所需试剂及设备定性定性1. 科立得试剂科立得试剂2. 取样瓶取样瓶（可用玻璃瓶替代）定量定量1. 科立得试剂科立得试剂 2. 取样瓶取样瓶（可用玻璃瓶替代）3. 51孔孔/97孔定量盘孔定量盘 4. 程控定量封口机程控定量封口机29colilert 使用总结使用总结检测指标检测指标培养温度培养温度()定性检测定性检测定量检测定量检测(100ml)总

18、大肠菌群和大肠埃希氏菌(同时)361黄色:总大肠菌群阳性黄色+荧光:大肠埃希氏菌51孔: 1-200mpn97孔:1-2419mpn粪(耐热)大肠杆菌44.5黄色:粪(耐热)大肠菌群阳性51孔: 1-200mpn97孔:1-2419mpn30科立得市场占有率科立得市场占有率 美国的市场占有率为95% 欧洲的市场占有率为90% 全国有20余家环境监测站（如北京、上海、四川、厦门、郑州、沈阳等） 、40余家自来水公司、35家省市级疾病预防控制中心及水文站31应用案例应用案例 2004年非典爱德士捐赠科立得试剂给中国cdc及上海cdc抗拒非典 2008年汶川地震爱德士公司捐赠1000套科立得试剂到四

19、川省cdc及环境监测站 2008年奥运会协助北京自来水及北京cdc完成奥运安全供水任务 与中国环境监测站、上海环境监测站及厦门环境监测站做了对比实验32 案例分析案例分析20042004年非典年非典爱德士捐赠科立得试剂给中国疾病预防控制爱德士捐赠科立得试剂给中国疾病预防控制中心及上海中国疾病预防控制中心抗拒非典中心及上海中国疾病预防控制中心抗拒非典困难困难解决解决时间紧24小时出结果任务重操作简便，无需判断典型菌落，对实验员专业水平要求不高责任大国标方法，结果准确可靠33 案例分析案例分析20082008年汶川地震年汶川地震爱德士公司捐赠爱德士公司捐赠10001000套科立得试剂到四套科立得试剂到四川省川省cdccdc及环境监测站及环境监测站第一家捐赠试剂到灾区的厂家第一家捐赠试剂到灾区的厂家困难困难解决解决条件恶劣无需专用的无菌室专业的操作人员少操作简单，无需专门培训，只需根据颜色变