临床微生物与免疫发展

1、第一节 临床微生物与免疫学发展史一、微生物、感染与免疫感染（infection）是指病原生物（包括致病性细菌、真菌、病毒和寄生虫） 入侵宿主，与宿主免疫防御系统相互作用，引起宿主不同程度病理变化的过程。AIDS ，即获得性免疫缺陷综合症， 由美国疾病控制中心的流行病学家于 1981 年在美国首先发现。反转录病毒 HIV 感染人体后，选择性吸附在靶细胞的 CD4 受体上，在细胞内经环化、整合、转录及翻译、装配、成熟及出芽，形成成熟的 病毒颗粒。机体产生抗 HIV 免疫，包括特异性免疫和非特异性免疫反应，一特 异性免疫反应为主。人体免疫系统主要通过针对 HIV 蛋白的各种特异性抗体、 特异性CD4

2、+ T淋巴细胞免疫反应和CTL直接或分泌各种细胞因子（如肿瘤坏死 因子,干扰素等 ），抑制病毒复制。“白色瘟疫”结核病历史悠久， 与人类同岁月。 最早的证据可追溯到新石器 时代。它曾在全世界广泛流行，夺去了数亿人的生命。目前全球大约 1/3 的人口 已感染结核分枝杆菌， 每年新发病例 900 万人。人型结核分枝杆菌主要通过呼吸 道、消化道和损伤的皮肤等多途径感染机体， 引起多种脏器组织的结核病， 以肺 结核多见，表现为咳嗽、 咯血等症状。 同时机体也会对结核分枝杆菌产生细胞免 疫和迟发型超敏反应。两位合作多年的澳大利亚科学家巴里 马歇尔与罗宾 沃伦（图1）,在发现了 幽门螺杆菌及其导致胃炎、胃

3、溃疡与十二指肠溃疡等疾病的机理 20 多年后，终 于收到了一份迟来的 “贺礼”，分享了 2005年诺贝尔生理学或医学奖。图12005年诺贝尔生理学或医学奖得主巴里马歇尔与罗宾沃伦幽门螺杆菌定植于胃窦部，借其特殊的螺旋体和端鞭毛穿过胃粘膜表面的黏 液层和上皮细胞接触，并且分泌脲酶分解尿素，产生氨中和菌体周围的胃酸。同 时能诱导胃粘膜上皮细胞产生多种细胞因子，引起炎症细胞释放多种酶类使胃组织损伤。二、感染的证据感染性疾病总是和病原体联系在一起，包括细菌、真菌、病毒和寄生虫。科 学、准确的病原学检测结果是感染诊断的金标准。然而，各种病原体的生物学特征的不同、现有检测方法和技术的限制、正常菌群和条件致

4、病菌的干扰以及个体 免疫状态的差异均可能构成病原学诊断结果的偏倚。因此，临床微生物工作者应 熟悉各种病原体的检测流程，掌握各种检测方法和技术的适应症， 综合分析病原 学检测的直接和间接证据，结合柯赫法则，使病原学诊断结果更加准确。微生物和感染性疾病之间的关系，长期以来一直被科学家们研究和关注， 直 到1876年，德国医生罗伯特.柯赫(Robert Koch，1843-1910)才第一次用实验 证明了炭疽杆菌和炭疽病之间的因果关系，并提出了著名的柯赫法则(Kochspostulates)，作为判断微生物和感染性疾病之间因果关系的标准。该法则包括如 下内容(图2)：病原微生物一定存在于感染性疾病个

5、体中，而在健康的个体 中不存在；一定能分离和纯培养所怀疑的病原微生物；当分离的病原微生物 接种敏感的动物模型时，可以导致相同的疾病；相同的病原微生物可再次从这 种被感染的动物模型中分离到。运用该法则，柯赫先后发现了炭疽、结核和霍乱 等感染性疾病的病原体。图2柯赫法则模式图然而，随着微生物学的进一步发展，人们对柯赫法则有了新的认识，尤其是 在以下几个方面认为柯赫法则还有待补充和发展：由于技术的限制，目前仍有一些微生物不能在体外获得纯培养，如麻风病的病原菌麻风分枝杆菌、洛矶山斑 疹热的病原菌立克次体等；有些感染目前仍然没有建立相应的动物模型，如导致淋病的淋球菌感染至今缺乏很好的动物模型；有些细菌本

6、来不致病，但是当菌群失调、获得了外来的毒力因子、因创伤或手术而到达无菌的深部组织以及宿 主免疫缺陷时而变为致病菌。尤其是20世纪30年代，病毒感染性疾病深入研究 和组织培养技术的快速发展，以洛克菲洛医学研究所的托马斯瑞沃斯(ThomasRivers )为代表的病毒学家发现，柯赫法则和许多病毒感染性疾病的实验研究结 果不符，如脊髓灰质炎患者组织中可以分离到链球菌，并可在体外获得纯培养， 注射到猴子或兔子等感染模型时也引起麻痹症状，而且可以再次从感染动物体内分离到链球菌，这些均符合柯赫法则，但当时的病毒学家们已经熟悉脊髓灰质炎 病毒的形态与链球菌有着明显的区别，而且知道多种微生物均可以引起麻痹症

7、状。于是瑞沃斯对柯赫法则做了有益的补充，更适合病毒感染病原体诊断的标准， 也有人称之为瑞沃斯法则(Rivers postulates：在所有患者体内均应该存在并 可以分离到该病毒， 而在健康者体内并不存在； 该病毒可以从患者体内分离并 可在实验室内利用宿主细胞进行体外培养； 可以通过微孔滤膜 （即病毒大小的 范围内）；当原先宿主或相关生物体和分离的病毒共培养时，会导致相应感染 性疾病的发生； 共培养的宿主体内可再次分离到该病毒； 感染后的宿主体内 可以检测到相应的病毒免疫反应。如 2003 年新出现的严重急性呼吸道症候群（Severe Acute Respiratory Syndrome, S

8、ARS），早期有关 SARS 的病原体可谓众 说纷纭，包括流感病毒、副粘病毒、衣原体和支原体等都曾被怀疑过，但这些病 原体均因不完全符合柯赫或瑞沃斯法则而逐一排除， 直到 2003年 3 月底，香港、 美国和德国的科学家终于找到了 SARS的致病原因，他们在SARS病人身上发现 了一种新的冠状病毒（coronavirus）。经细胞培养、电子显微镜观察、聚合酶连 反应（PCR）及间接免疫荧光抗体检验（in direct immu nofluoresce nt an tibody test） 等实验证据，以及后来人工感染一种南美的猴子后， 猴子也显现出SARS间质性 肺炎的症状， 并且在感染的猴肾

9、组织中再次分离到该病毒。 所有这些均符合柯赫 或瑞沃斯法则，因此WHO在2003年4月16日宣布这种从未在人体与动物体内 被发现的一种全新的冠状病毒是 SARS的致病原因。三、临床微生物与免疫学检验的辉煌历史（一）临床微生物的发展历程1. 史前时期直观应用时期自古以来，人类在日常生活和生产实践中，已经觉察到微生物的生命活动及其 所发生的作用。中国利用微生物进行酿酒的历史，可以追溯到4000多年前的龙山文化时期。殷商时代的甲骨文中刻有 “酒”字。春秋战国时期，就已经利用微生 物分解有机物质的作用，进行沤粪积肥。北魏贾思勰的齐民要术中，有谷物 制曲，酿酒、制酱、造醋和腌菜等方法。2. 初创时期形态

10、发展时期17世纪，荷兰人列文虎克用自制的简单显微镜 （图3）可放大160260 倍, 观察牙垢、雨水、井水和植物浸液后，发现其中有许多运动好着的 “微小动物 ”， 并用文字和图画科学地记载了人类最早看见的 “微小动物”。 细菌的不同形态（球状、杆状和螺旋状等）。过了不久，意大利植物学家米凯利也用简单的显微 镜观察了真菌的形态。国Ki l.i住砖范列玄庇克鮎2-门和他拚0社镜一 粥丈曲番F 持显敝廃（IJ 蚩也做谩的輔成1/山n进锻：h装样什：社J州報 距的懺険 何 叫丈睨克绘制的覃自人切IB中的HU jjI fl Dobd, 讪伽、啊 I尸ii计|神丄 jEijil H祗jilk AiimiH

11、iJ （WS2L Hsajll 消ndHizlL 195S.图3列文虎克及其自制的简单显微镜3. 奠基时期一生理学发展时期微生物学的研究从19世纪60年代开始进入生理学阶段。法国科学家巴斯德 对微生物生理学的研究为现代微生物学奠定了基础。千百年来普遍流传着一种“自然发生说”。该学说认为，不洁的衣物会滋生 蚤虱，污秽的死水会自生蚊，肮脏的垃圾会自生虫蚁，粪便和腐臭的尸体会自生 蝇蛆。总之，生物可以从他们所在的物质元素中自然发生，而没有上代。1668年意大利宫廷医生佛罗伦萨实验科学院成员F.雷迪用实验证明腐肉生蛆是蝇类产卵的结果，首先对自然发生说提出异议。但由于他未能正确解释虫瘿 与肠道蠕虫的来源

12、，人们认为低等动物仍可自然发生。1745年英国天主教神甫、显微镜学家J.T.尼达姆用各种浸泡液经消毒后，仍有微生物发生，而坚持自然发 生说。1775年意大利生理学家L.斯帕兰扎尼通过一系列实验，证明J.T尼达姆实 验结果是由于加热不够和封盖不严所造成， 因而确信微生物是从空气带入的。但 他的批评者宣称，由于他使浸出液在密闭管内煮沸了45分钟，杀死了管内空气 中的活力”因而影响了自然发生。1837年T.A.H.施万改进了斯帕兰扎尼的实 验,通入事前经过加热或 “焙烧”的空气,并以青蛙仍能在其中生活，证明并未影响 活力”的存在。但T.A.H.施万的实验由于存在某些技术问题，结果并不稳定。巴斯德根据

13、自己的研究实践， 不相信微生物可以自然发生， 认为微生物肯定 必有母体。 他到处宣传这一理论。 这下子可激怒了自生论者。 他们问巴斯德： “酵 母怎在地球的每一个角落里，在每一世纪的每一年里，不知道从什么地方出现， 把葡萄汁酿成酒？这些从天南地北， 处处把每个罐里的牛奶变酸， 每瓶里的牛油 变坏的小动物来自什么地方？为了回答这些挑战， 巴斯德重做了斯帕兰扎尼的实验。 他在圆瓶里灌进一些 酵母汤，把瓶颈焊封，煮沸几分钟后搁置适当时间。结果表明，瓶里并没有微生 物生长。这一试验并不能彻底驳倒自生论者。 他们坐在巴斯德的书房里吵吵闹闹： “你在煮沸酵母汤时，把瓶里的空气加热了。酵母汤产生小动物所需要

14、的是自然 的空气。你不能把酵母汤和天然的未经加热的空气放在一起而不产生酵母、 霉菌、 杆菌或小动物！ ”面对对方的指责， 巴斯德冥思苦想， 决心设计一种只让天然空气进入而不许 其中的微生物进入的仪器。 在老教授巴拉的指导下， 巴斯德终于设计、 制作出了 符合这一要求的仪器，即著名的曲颈瓶。实验取得了完全的成功。巴斯德著名的曲颈瓶实验（图 4）：曲烧瓶有一个弯曲的长管与外界空气相 通。瓶内的溶液加热至沸点，冷却后，空气可以重新进入，但因为有向下弯曲的 长管，空气中的尘埃和微生物不能与溶液接触， 使溶液保持无菌状态， 溶液可以 较长时间不腐败。 如果瓶颈破裂， 溶液就会很快腐败变质， 并有大量的微

15、生物出 现。实验得到了令人信服的结论：腐败物质中的微生物是来自空气中的微生物。Ai* kxsd out open endslowlySlerite lor many1 押14/1FT BfMd n鼻* 亠Mfcwtwpant&ms grow in teqi*d图4巴斯德曲颈瓶实验4. 发展时期一生物化学水平1897年德国人毕希纳(E.B tchner)用无细胞酵母菌压榨汁中的 酒化酶” 对葡萄糖进行发酵获得成功，从而开创了微生物系列生化研究的新时代。1929年英国医生弗莱明发现青霉素能抑制细菌生长，1928年7月下旬，弗莱明将众多培养基未经清洗就摞在一起，放在试验台阳光照不到的位置，就去休假了

16、。9月3号，度假归来的弗莱明，刚进实验室，其前任助手普利斯来串门， 寒暄中问弗莱明最近在做什么，于是弗莱明顺手拿起顶层第一个培养基，准备给他解释时，发现培养基边缘有一块因溶菌而显示的惨白色，因此发现青霉素，并于次年6月发表，最终使其获诺贝尔奖的论文。1943年，英、美合作研究开发 了青霉素的通气搅拌部培养法，开始了青霉素的大批量生产。5. 成熟时期分子水平1926年汉斯 布什研制了第一个磁力电子透镜。1931年厄恩斯特 卢斯卡和 马克斯 克诺尔研制了第一台透视电子显微镜并于 1986年卢斯卡获得诺贝尔物理 学奖。 1938年他在西门子公司研制了第一台商业电子显微镜。1952年，奥地利裔美国生物

17、化学家查伽夫测定了 DNA 中 4种碱基的含量， 发现其中腺膘呤与胸腺嘧啶的数量相等，鸟膘呤与胞嘧啶的数量相等。 1953 年， 沃森和克里克发现了 DNA 双螺旋的结构，开启了分子生物学时代。1985年，凯利 穆利斯在美国Cetus公司工作期间，发明了聚合酶链式反应 (PCR)。在工作中，穆利斯需要合成DNA引物来进行测序工作，但常常因为没 有足够多的模板 DNA 而烦恼。一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上，猛 然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。随后他用同位素标记法看到了 10 个循环 后的 49bp 长度的第一个 PCR 片段，并申请了专利，从此全世界开始学习 PCR 的方法，微生物也

18、因此开拓了分子诊断领域。(二) 临床免疫学检验的发展历程1.经验免疫学阶段天花是一种烈性传染病， 得病者死亡率非常高。 严重损坏人容貌的麻子， 就 是感染天花后留下的点点疤痕。 天花大约在汉代由战争的俘虏传入我国。 长期以 来，人类对于天花病一直没有有效的防治方法。 我国古代人民在同这种猖獗的传 染病不断作斗争的过程中， 于明代发明了预防天花的方法人痘接种法。 峨眉山神 医为王素种痘的故事， 是目前发现的中国典籍上最早的种痘记载。 宋真宗赵恒在 位时，宰相王旦一连生了几个子女， 不幸都死于天花。 待到老年他又得了一个儿 子，取名王素。 王旦担心这个儿子再遭天花残害， 于是召集许多医师商议防治痘

19、 疮的方法。有人说，四川峨嵋山有一个 “神医 ”能接种人痘预防天花，王旦听后心 中大喜。就在峨眉山找到神医道士给王素种痘， 结果王素果然没有感染天花， 活 到七十六岁。继人痘苗之后， 免疫学的一个重要发展首推牛痘苗的发明。 它不但弥补了人 痘苗的不足，并且可在实验室大量生产。英国医生爱德华 詹纳观察到挤奶女工 在患过牛痘后不易得天花病的事实后， 通过对牛痘苗人体的长期实验， 确证接种 牛痘苗后可以预防天花，并对人体无害。 1796 年他用牛痘疹的浓浆首次试验给 一名 8 岁儿童接种，预防天花获得成功， 为人类传染病 的预防开创了人工免疫的 先声，宣告了免疫学的诞生。2.科学免疫学阶段德国细菌学

20、家、免疫学家保罗 埃尔利希在1897年他首先提出了抗体生成的 侧链学说， 也是受体学说的首创者。 他认为抗毒素分子存在于细胞表面上， 当外 毒素进入体内后与之特异结合， 并刺激细胞产生更多的抗毒素分子， 自细胞表面 脱落入血流即是抗毒素，认为抗体和抗原如同“钥匙和锁的匹配” ，并发现了补 体的效应功能，被称为“体液免疫之父” 。俄国科学家梅切尼科夫发现巨噬细胞 和小噬细胞可以清除病原菌， 提出了“细胞吞噬学说”，被誉为“细胞免疫之父”， 两人于 1908 年被授予诺贝尔医学奖。体液免疫和细胞免疫学说的形成，标志着 免疫学科理论构架的形成。1984年德国科学家乔治斯克勒和英国科学家色萨米尔斯坦共

21、同研究开发 了一套制造单克隆抗体的新技术， 是 20世纪 70年代医学和生物学领域中的一次 革命，对生命科学及医学的几乎所有领域都产生了深远的影响。 它使免疫学一些 基础理论的研究有了很大进步， 并被应用于激素、 酶和一些具有生物活性物质的 鉴定、纯化以及肿瘤的早期诊断和治疗。随着基因克隆和基因工程等先进技术的发展， 分子免疫学也获得了飞速进步。 分 子免疫学快速地把免疫分子的结构与功能联系起来进行全面深入的研究， 同时还 可从 DNA 复制、转录和蛋白翻译等多个层面研究免疫分子结构和功能的关系。第二节 临床微生物与免疫学检验专业范畴经典的病毒学检查方法包括病毒分离鉴定和血清学诊断（抗体的检测

22、） 。由 于分子病毒学和免疫学的发展， 近年来又建立了许多诊断方法， 包括电镜直接观 察形态、检查病毒抗原、核酸等，使得病毒感染的快速诊断成为可能。以乙型肝炎病毒为例， 临床主要用免疫学方法检测血清中乙肝病毒表面抗原 和抗体、病毒e抗原和抗体以及病毒核心抗体。随着分子生物学的快速发展以及 PCR的广泛应用，可以用分子诊断方法检测乙型肝炎病毒的核酸，达到快速准确的诊断 4.寄生虫寄生虫的病原学诊断主要依靠对粪便、 血液、活体组织和其他排泄物抽取物 的检测。 以蛲虫为例， 蛲虫的传染主要在幼儿及儿童间传染较为广泛， 当宿主睡 眠肛门括约肌松弛时，雌虫下移至肛门外，产卵于肛周周围和会阴皮肤皱褶处。

23、由于此特殊的产卵习性，透明胶纸粘拭法阳性率可达 79.4%。透明胶纸粘拭法即 在早晨排便前用透明胶纸粘拭肛门周围皮肤， 在显微镜低倍镜下检查， 连续三次。（二）抗生素合理利用当前，我国医药卫生事业补偿不足， 大部分公里医药靠创收弥补不不足， 其 中药品收入占了四成以上， 形成了以药养医的机制。 多年来， 抗生素一直以其使 用广、利润高、回扣丰，成为医药药品收入中的“老大” 。医生的盲目诱导，往 往让患者只看到了抗生素的快速有效，却忽视了其耐药后果。在细菌耐药日益严重的情况下，万古霉素曾一度作为抗感染治疗的有效手 段。2002 年科学家在医院中发现了“耐万古霉素金黄色葡萄球菌（ VRSA ）”。

24、它 们拥有一个耐万古霉素的“基因盒” ，可以改变万古霉素在病菌细胞壁上的作用 位点，使其无法与相应位点结合，让作为医生手里“最后一张王牌”的万古霉素 彻底失效。2013年 3月 5 日美国疾病控制和预防中心发布名为致命迹象的报告称， 过去十年， 一类非常致命的超级细菌在美国医护机构的传播数量不断增多， 其耐 药性也越来越强，即耐碳青霉烯类肠杆菌属（CRE）,因对治疗严重细菌感染的 重要级武器碳青霉烯类广谱抗生素具有极强的耐药性而得名。 此类细菌之所以被 称为“超级细菌” 是因为它对很多新的抗生素都有耐药性， 如今最强的抗生素对 它们已不管用，很多患者面临无法治愈的感染，死亡率非常高。（三）院内

25、感染的监测院内感染是指在医院中获得的感染， 感染来源包括外源性和内源性， 外源性 感染来自于另一感染者或环境； 内源性感染来自于患者自身， 是由于正常菌群的 迁徙至机体其他部位， 或受损组织、抗菌药物的不合理使用导致病原菌过度生长。常见的院内感染包括泌尿道感染、呼吸道感染、外科伤口感染、血液感染有效的感染控制依赖于实验室准确检测病原菌的能力， 临床微生物实验室是 感染控制计划的重要组成部分，在院内感染监测、暴发调查中起着重要的作用， 提供微生物学证据以及调查线索。药敏试验是临床微生物学实验室的常规实验， 通过分析药敏试验结果， 能够 初步判断菌株间差异；随着分子生物学技术的发展，分析微生物特征

26、性 DNA 越 来越多的应用于病原体分型，常用的技术包括凝胶电泳技术，PCR技术，Southern Blot 技术，染色体原位杂交技术以及基因诊断技术等。总之，临床微生物实验室是感染控制计划的重要组成部分， 临床实验室新技 术的产生与应用将大大增强感染控制效果。(四) 新的抗感染药物的发现与研究新抗生素的筛选仍然是新抗菌药物发现的重要途径。 当前各大类抗生素均有 所发展，伕内酰胺类抗生素特别是头抱菌素在抗生素领域仍占主导地位。出现第 四代头抱菌素头抱匹罗(Cefpirom)、头抱吡肟(Ce鄄fepime)、头抱唑兰 (Cefozopran)与头抱噻利(Cefoselis);碳青霉烯类在保持对肾

27、脱氢肽酶稳定 的基础上，其抗菌活性、安全性和药代动力学特征不断得以改善。大环内酯类抗生素已由第一代发展到第三代。 当前研究的主要动向是继续采 用化学与生物学等方法修饰结构，以改善其耐药性并研发其在抗菌以外的应用。氨基糖苷类抗生素通过结构修饰已明显改善了耐药性， 近年又研制出抗耐甲 氧西林金葡菌(MRSA)的新氨基糖苷类药物。阿贝卡星(Arbekacin)和依替米 星( Etimicin )对 MRSA 均较强作用。MRSA、 PRSP、 VRE 是目前临床常见的几种重要的耐药革兰氏阳性菌。近 年来新发现的对多重耐药金葡球菌、 MRSA、 VRE 等有较强作用的其它新抗生素 包括了酮内酯类、脂肽

28、类、脂糖肽类、长链烯酸类、含噻唑与 唑的环肽等。过去的抗菌药都是直接作用于细菌病原体。 近年来的抗菌药物开发， 除继续 致力于筛选对耐药菌有效的、 具有新抗菌谱和新作用机制或新作用靶位的抗菌药 之外，还注意寻找提高与保护抗菌药效能、增强机体防御机能和衰减微生物病原 性的物质。近年来，其它如渗透性促进剂、外排泵抑制剂、生体防御机能调节剂、 微生物感染途径阻断与病原性衰减剂的研究也颇受重视。二、临床免疫学检验的范畴1细胞免疫的检测与应用细胞免疫，即T细胞受到抗原刺激后，分化增殖，转化为致敏 T细胞。当 相同抗原再次进入机体，致敏 T细胞对抗原的直接杀伤作用及致敏 T细胞所释 放的淋巴因子的协同杀伤

29、作用。在抗感染免疫中，细胞免疫主要参与对胞内寄生 的病原微生物的免疫应答及对肿瘤细胞的免疫应答， 参与迟发型超敏反应和自身 免疫病的形成，参与抑制排斥反应及对体液免疫的调节。人体细胞免疫功能与T细胞的数量及功能密切相关。T细胞计数可以通过E 玫瑰花环试验。成熟的人T细胞表面表达CD2分子，及绵羊红细胞受体，能和 绵羊红细胞结合形成玫瑰花环样结构（图 7），然后在显微镜下观察计数。图7 E玫瑰花环试验此外，外周血成熟的T细胞表达有特有的CD3和T细胞受体（TCR）表面 抗原，将T细胞标记特定的抗体，利用流式细胞流式细胞技术即可对 T细胞进 行计数。同时可根据辅助性T细胞、细胞毒T细胞表面CD4和CD8抗原表达的 差异，