医学交流课件：NGS在结直肠癌精准诊断中的应用

1、NGS在结直肠癌精准诊断中的应用燃石历程NGS精准检测全产业链合作模式nIllumina中国战略合作伙伴nIllumina中国唯一授权肿瘤Pannel开发伙伴n安捷伦中国战略合作伙伴nCSCO肿瘤驱动基因分析联盟（CAGC）制定NGS临床应用共识以及后续验证项目首要参与单位n燃石-CTONG联合检测所nCACA-Gi遗传学组项目唯一NGS合作者n中华医学会血液分会及CACA血液肿瘤专业委员会NGS合作方n已与国内18家顶级医院共建NGS实验室；14家医院洽谈中n阿斯利康肺癌NGS唯一合作伙伴；BRCA合作伙伴（协议签署中）；妇基会卵巢癌BRCA登记项目n辉瑞n诺华n和记黄埔n正大天晴n恒康医疗

2、结直肠癌中分子诊断的意义u抗EGFR抑制剂原发耐药机制的鉴别u 晚期患者的靶向药治疗u遗传性结直肠癌的确诊u 患者的手术选择及术后随访u 家属的监控措施u微卫星不稳定状态的检测u II期患者化疗方式的选择u 晚期患者免疫治疗的选择Misale S et al. Cancer Discov. 2014 抗-EGFR原发耐药机制KRASNRASBRAFHER2/MET amp de novo耐药亚克隆通过克隆选择获得优势，导致PD 克隆进化可产生新的耐药亚克隆 肿瘤异质性：同一病灶内或不同病灶之间可存在多种耐药亚克隆抗-EGFR耐药的分子机制NCCN指南推荐靶向治疗之前检测指南推荐靶向治疗之前检测

3、KRAS, NRAS 及及 BRAF V600E相关基因遗传性CRCMLH1/MSH2/MSH6/PMS2/EPCAMLSAPCFAPSTK11PJSBMPR1A/SMAD4JPSMUTYHMAPPTENCSTP53LFSGREM1/BMPR1AHMPSPOLD1/POLEPPAPATM/BLM/CHEK2CRC风险Lynch HT, et al. Chin Clin Oncol. 2013;2(2):12.Adapted from NCCN guideline_genetic/familial high-risk assessment: colorectal_v 1.2016遗传性结直肠癌的

4、重要性和多样性Orphanet J Rare Dis. 2009 Oct 12;4:22.诊断遗传性结直肠癌的意义MLH1/MSH2MSH6PMS2APCMUTYHSTK11BMPR1A/SMAD4PTENTP53GREM1LIFETIME RISK 诊断遗传性结直肠癌的意义林奇综合征的既往筛查路径 NCCN指南推荐70岁及70岁且符合Bethesda标准的患者进行MMR（MSI）检测 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和EPCAM中任一基因胚系突变阳性者确诊为Lynch综合征 致病基因携带者应按指南推荐进行密切随访、监测 既往报道指出MLH1，MSH2和MSH6胚系突变占所有Lynch综

5、合征基因突变的90%;Myriad NGS Panel(25个基因)检测数据统计显示，MLH1和MSH2突变仅占62%，其余三个基因MSH6,PMS2和EPCAM也很重要J Genet Counsel (2012) 21:484-4932014 ASCO Multigene panel testing in patients suspected to have Lynch syndrome.MLH1, 27%MSH2, 35%MSH6, 23%PMS2, 12%EPCAM, 3%NGS的出现改变Lynch的筛查与诊断Lynch, MMR与MSI*MSI vs. IHC:MSI-H dMMR(d

6、eficient mismatch repair); MSI-L/MSS pMMR(proficient mismatch repair) MMR基因胚系突变 (Lynch)MMR蛋白表达缺失MSI(微卫星不稳定)MMR基因修饰（甲基化）NGSIHCNGSMMR蛋白蛋白（IHC）MSI状态状态（PCR/NGS）dMMRMSI-HpMMRMSI-LpMMRMSSMMR基因体系突变DNAProteinDNAPCR微卫星不稳定在结直肠癌治疗中的意义：化疗II期结肠癌均应检测MMR或MSI因为MSI-H的II期结肠癌预后良好（单纯手术5y-OS率80%），且不能从5FU辅助化疗中获益（反而有害）微卫星

7、不稳定在结直肠癌治疗中的意义：免疫治疗Dung T. Le, et al. 2016 ASCO abs 103dMMR的中位PFS和OS尚未达到，因随访时间已2年，预期会是一个相当高的数字，与pMMR对比鲜明！ 肿瘤组织一肿瘤组织一站站式检测，涵盖式检测，涵盖 36 基因基因 + 22 MSI位点位点燃石新凯康Panel完全覆盖结直肠癌的分子检测需求NGS应用于结直肠癌的分子诊断难点u抗EGFR抑制剂原发耐药机制u 点突变 + 扩增u遗传性结直肠癌的诊断u 胚系突变的解读u微卫星不稳定状态的检测u 利用捕获测序一次检测突变和微卫星不稳定胚系突变如何进行解读美国医学遗传学会推荐的胚系突变解读流程

8、美国医学遗传学会推荐的胚系突变解读流程序列特征家系分离软件预测蛋白结构可变剪切功能研究突变频率证据强度分级非常强强中等支持综合评分，突变分级1良性2可能良性3不确定4可能致病5致病燃石的胚系突变注释流程发现胚系突变胚系突变数据库注释YESNO无冲突：采用数据库注释数据库无注释或互相冲突健康人数据库搜索文献检索证据综合与分级影响蛋白质功能同义突变，不影响剪切错义突变，不影响功能 致病或可能致病不确定综合软件预测修正分级不确定可能良性良性或可能良性健康人群中高于5%其它证据综合为致病数据库比对人工解读生物信息分析NGS应用于结直肠癌的分子诊断难点u抗EGFR抑制剂原发耐药机制u 点突变 + 扩增u

9、遗传性结直肠癌的诊断u 胚系突变的解读u微卫星不稳定状态的检测u 利用捕获测序一次检测突变和微卫星不稳定什么是MSI传统PCR方法如何检测MSI传统方法: PCR 检测五个单核苷酸位点五个单核苷酸位点(NR27, NR21， NR24 ，BAT25 and BAT26) NGS如何检测MSI15T dup计算该repeat在测序数据中的长度分布，以下是在18个正常样本中的长度分布CAACC 15T CCTTT哪些是MSI的样本？通过length分布来识别MSITumorNormalTumorNormalMSI-H样本举例RS1611034FFP TumorNormalTumorNormal所有

10、位点均为MSI.MSS样本举例RS1611036FFP所有的位点均为MSS.TumorNormalTumorNormal燃石燃石NGS检测检测MSI与金标准对比与金标准对比敏感性敏感性96.4%特异性特异性100% 肿瘤组织一肿瘤组织一站站式检测，涵盖式检测，涵盖 36 基因基因 + 22 MSI位点位点燃石新凯康Panel完全覆盖结直肠癌的分子检测需求抗抗EGFR治疗治疗遗传综合征确诊遗传综合征确诊微卫星不稳定性检测微卫星不稳定性检测Thanks for your attentionBackup Slides胚系突变Germline mutation突变丰度突变丰度 0% 50% 100%c

11、hr17chr17GGchr17chr17AGchr17chr17AAG/G 基因型G/A 基因型A/A 基因型chr17Gchr17Achr17Gchr17A卵子卵子精子精子胚系突变 在个体所有细胞都携带SNP体细胞突变Somatic mutationchr17chr17CCchr17chr17AC突变丰度50%Normal cellTumor cellchr17chr17CCchr17chr17ACchr17chr17ACchr17chr17ACchr17chr17CCchr17chr17AC肿瘤细胞占比66%，突变丰度33%大多数情况下，肿瘤细胞占比不是100%，所以突变丰度一般都会小于50%有两种情况，突变丰度可以超过50%chr17AWild-type copy lossMutation copy gainchr17chr17ACAAA首先，肿瘤组织包含所有胚系突变，包含常见变异（SNP），罕见胚系突变胚系突变体细胞突变NGS其次，带有肿瘤细胞特有的体细胞突变，例如TP53，EGFR等检测肿瘤组织，既可以看到体细胞突变，也可以看胚系突变胚系突变+体细胞突变Somatic mutationGermline mutation只有肿瘤细胞携带，其他细胞不携带丰度通