循环肿瘤标志物CTC检测技术在肺部小结节诊断中的进展

1、循环肿瘤标志物（CTC）检测技术在肺部小结节诊断中的最新进展Lung Cancer in Solid Tumor in ChinaLDCT筛查降低肺癌死亡率筛查降低肺癌死亡率NLST research team. NEJM, 2011胸部胸部CT筛查与过度诊疗的悖论筛查与过度诊疗的悖论大部分非实性成分的结节为良性疾病大部分非实性成分的结节为良性疾病26.2%自行消失仅3%确诊为肺癌将所有肺部结节计算在内，假阳性率为21.8%-26.6%左右Pinsky FR, et al. Ann Intern Med, 2015 比较了两个大型临床研究的假阳性率 NEJM发表的NLST研究中假阳性率第一次筛

2、查为26.6%，第二次筛查为21.8%如何解决？如何解决？第1-3次胸部CT筛查相比，第4次行胸部CT时 I期肺癌的比例下降20%如何解决？如何解决？PET-CTPET-CT对于肺部良性结节，假阳对于肺部良性结节，假阳性率约性率约45%45%Veronesi G, et al. Ann Int Med 2012如何解决？如何解决？ 创伤性检查 不良反应大 部分患者无法耐受肺癌病理活检局限性肺癌病理活检局限性 成本高 术后并发症 对于部分年老或合并基础疾病的患者如何解决: 能否有更敏感的肿瘤标志物来帮助诊断液态活检在肺癌中的应用液态活检在肺癌中的应用治疗策略事件肺癌待查辅助诊断早癌肺癌晚期肺癌癌

3、症耐药复发监测治疗方案选择疗效评估耐药机理新药研发治疗策略事件疑似肺癌辅助诊断早癌肺癌晚期肺癌癌症耐药复发监测治疗方案选择耐药机理新药研发CTCCTC的临床应用价值的临床应用价值疗效评估CTC(数量）(负向富集+靶向PCR）ctDNA(基因变异）1、K. Pantel, et al. Nat Rev Clin Oncol, 2009;2、K. Pantel and MR. Speicher, Oncogene 2015什么是循环肿瘤细胞（什么是循环肿瘤细胞（Circulating Tumor CellCirculating Tumor Cell，CTCCTC）？）？肿瘤释放如外周血中肿瘤释放如

4、外周血中CTCsCTCs数量的多少数量的多少，可间接反应肿瘤发生发展的功能状态，可间接反应肿瘤发生发展的功能状态CTCCTC：在肿瘤发生过程中，具有干细胞特征的肿瘤细胞和不具有干细胞特征的肿瘤细胞，均由原发肿瘤脱落释放入外周血，两者统称循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell）CTC1CTCCTC有转移有转移：侵入第二器官CTCs，称之为DTC（disseminated Tumor Cell），只有由具有干细胞特征干细胞特征的DTC所形成形成的微转移灶的微转移灶，逃避免疫识别逃避免疫识别才可能发展成为肿瘤远处转移2CK+ cellsHER-2+ cells第9周的乳腺管组织切

5、片：乳腺管周围非典型性增生第30周的肿瘤组织切片：新生的肿瘤上皮细胞形成牙槽并侵袭周围基质什么时候可以检测到CTC？早期肿瘤外周血中即可检出CTCW He, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007早期肿瘤外周血中即可检出早期肿瘤外周血中即可检出CTCCTCl表达中等量FR的M109鼠肺癌细胞通过皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部侧面l移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分钟可以检测到大约1.4个CTC细胞l移植后第3和第4周，则每分钟可分别检测7个和18个CTC，随着肿瘤逐渐增大数量呈指数上升l在肿瘤移植的前4周内，没有在任何组织切片中发现到存在转移性癌症的迹象C

6、TC富集技术 密度与大小 免疫磁珠（负向富集 or 阳性富集) 微流体CTCCTC检测方法检测方法CTC检测技术靶向PCR免疫荧光普通PCR=+“方法”“收获”“垃圾”蟹饵没水了，我们躲不了了放水负向富集负向富集优势：回收率100%劣势：纯度略低正向富集正向富集优势：纯度高劣势：回收率低（漏掉CTC）幸好没贪嘴，我们逃了“方法”“收获”“垃圾”没水了，我们躲不了了放水负向富集负向富集优势：回收率100%劣势：纯度略低大小富集（大小富集（ISETISET）优势：简单劣势：漏掉小的CTC细胞幸好没吃胖，我们逃了网筛CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术负向富集靶向PCRFR阳性靶标

7、l肺癌细胞FR(叶酸受体）高度表达lCTC：FR=1:50万lEMT转化不影响FR丰度l其他血细胞不表达FRlCTC回收率接近100%l磁珠富集易操作和自动化l灵敏度超高灵敏度超高，负向富集即可检测l信号二次放大，1: 1012倍放大l无需人工经验判读，结果客观准确l可实现CTC的定量CytoploRare FR靶向靶向PCR CTC检测检测格诺CytoploRare 灵敏度最高的检测技术l 特异性DNA PCR扩增-提高敏感性l FR靶向：高特异性探针l 1 CTC in 6,000,000（可在600万个背景细胞中检测出一个CTC）CytoploRarel敏感性l特异性l可重复性l临床应用

8、便捷性CytoploRarel敏感性l特异性l可重复性l临床应用便捷性CytoploRare FR靶向靶向PCR CTC检测检测靶向靶向PCRPCR，信号放大，保证高度敏感性，信号放大，保证高度敏感性1个CTC信号放大1012倍CytoploRare FRFR靶向靶向PCR CTCPCR CTC检测检测敏感性试验：敏感性试验：1ctc in 1,200,0001ctc in 1,200,000白细胞白细胞Jiatao Lou, et al. Plos One 2013l 将不同数量的FR阳性肿瘤细胞分别掺入3ml全血(1.2-3.0X107）l FR靶向PCR CTC检测技术的回收率接近100

9、%，且呈线性分布l检测灵敏度约为5.09/（1.23*107）=1/240万600万掺入细胞数量掺入细胞数量( (个个) )复管复管1 1复管复管2 2复管复管3 3检测均检测均值值检出细胞数检出细胞数( (个个) )回收率回收率(%)(%)平均回收率平均回收率(%)(%)R R600571.52 565.13 586.37 574.34 584.12 97.35 98.75 0.9990.9998 8200198.93 192.81 185.90 192.55 192.46 96.23 5056.56 52.07 50.80 53.14 49.44 98.89 59.90 9.26 10.5

10、8 9.91 5.09 101.87 0 05.00 5.44 4.40 4.95 0.00 /l 将不同数量的FR阳性肿瘤细胞分别掺入3ml全血(1.2-3.0X107）l 检测灵敏度约为5.09/（1.23*107）=1/240万600万CytoploRare FR靶向PCR CTC检测敏感性试验：1ctc in 6,000,000白细胞CytoploRarel敏感性l特异性l可重复性l临床应用便捷性CytoploRare FR靶向靶向PCR CTC检测检测技术技术FR（叶酸受体，高度特异性的靶向探针）（叶酸受体，高度特异性的靶向探针）l 特异性高：特异性高：加入FR靶向探针前，加入高浓度

11、叶酸封闭细胞表面的叶酸受体，检测结果为阴性l 背景表达：背景表达：去除FR靶向探针，仅保留特异性DNA片段，与保留FR靶向探针相比，检测结果一致，提示背景可能为特异性DNA片段所致的固定值Jiatao Lou, et al. Plos One 20132004Cell Search: Cell Search: 乳腺癌中检测出，但肺癌敏感乳腺癌中检测出，但肺癌敏感性低性低2011Cell Research: 采用的抗体采用的抗体(EpCAM)对对EMT细胞特异性差细胞特异性差，而肺癌细胞转移入血需要EMT的过程EpCAM阴性细胞中，存在大量CTC Cell Research系统主要使用EpCAM

12、（上皮粘附分子）做为探针 研究证实，EpCAM阴性的细胞中也存在CTCJiatao Lou, et al. Plos One 2013l 有报道，部分激活的巨噬细胞存在FR的高表达1l 临床前研究证实，这部分巨噬细胞很少在正常人的外周血中出现2l 使用抗CD14免疫磁珠去除巨噬细胞后，CTC的检测结果无明显改变31、He W, et al. Int J Cancer 2008; 2、He W, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007; 3、Jiatao Lou, et al. Plos One 2013CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术巨噬细胞（可能

13、存在FR表达）不影响检测结果CytoploRarel敏感性l特异性l可重复性l临床应用便捷性CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术同一患者重复检测，可重复性高CytoploRarel敏感性l特异性l可重复性l临床应用便捷性3mL血6个小时得到报告检测流程检测流程肺癌领域，肺癌领域，CTCCTC检测技术对比检测技术对比CytoploRare（格诺）CellSearchCyttelTM（北京莱尔）CanpatrolTM（益善）CTC-Biopsy（武汉友之友)核心技术免疫磁珠负向富集靶向配体PCR技术 流式正向富集技术荧光标记免疫磁珠负向富集、Fish技术ISET（滤膜）原位杂交R

14、NA分析ISET（滤膜)荧光标记特异性88%80%83%75%70%灵敏度80%30%腺癌：46%30%30%自动化半自动全自动半自动半自动全自动血样体积3mL7.5mL4mL5mL10mL适应症早、中和晚期早、中和晚期肺癌晚期乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌晚期肺癌、胰腺癌、乳腺癌晚期癌肿晚期癌肿早期（I期）敏感性68%0%20%(2/10)未报道未报道中晚期敏感性89%25%（22/87)61%-88%30%40%报告时间6h/12样本样本6h/8样本48h/1样本48h/1样本3天可视化否否是是是是1210例受试者肺癌560例肺部良性疾病350例其他肿瘤 (150例) 肝癌 30例结直肠癌 3

15、0例 乳腺癌 30例 胃癌 30例 食管癌 30例331例A A100例B B 50例C C（21例D D) 79例DDA: 基线CTC检测B：术前术后CTC监测C：一线含铂双药化疗中CTC监测D：基线CTC、CEA、CYFRA21-1、SCC、NSE检测 300例A A 50例D D健康人150例100例A A 50例D D150例A A非动态研究非动态研究 肺癌 560例A A肺部良性疾病 350例A A 健康人 150例A A 动态监测研究动态监测研究 非小细胞肺癌 100例B B 50例C C对比研究对比研究 肺癌 100例DD 肺部良性疾病 50例DD 健康人 50例DD肿瘤特异性研

16、究肿瘤特异性研究 其他肿瘤 150例A A FRFR靶向靶向PCR CTCPCR CTC检测技术检测技术临床试验设计（1210例, 全国肺癌CTC研究最大样本量）Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015参加单位：上海市肺科医院上海市胸科医院上海市胸科医院医科院肿瘤医院特征特征例数例数(%)(%)肺癌（肺癌（n=560n=560）年龄（平均值，范围）59.3岁(21-79岁)性别（男性/女性）349/211TNMTNM分期分期期期150(26.

17、8%)150(26.8%)期48(8.6%)期157(28.0%)期205(36.6%)病理亚型病理亚型非小细胞肺癌465(83.0%)肺腺癌320(68.8%)肺鳞癌107(23.0%)大细胞肺癌5(1.1%)肺腺鳞癌1(0.2%)其他非小细胞肺癌32(6.9%)小细胞肺癌81(14.5%)其他肺癌14(2.5%)肺部良性疾病（肺部良性疾病（n=350n=350）患者特征Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015FRFR靶向靶向PCR CTC

18、PCR CTC检测技术检测技术叶酸受体阳性叶酸受体阳性CTCCTC作为肺癌诊断的标志物作为肺癌诊断的标志物 最大样本量最大样本量CTCCTC检测数据检测数据 CutoffCutoff： 8.70 CTC Units/3mL敏感性：敏感性：79.6%79.6%特异性：特异性：88.2%88.2%Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2013; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015AUC: 0.8797FRFR靶向靶向PCR CTCPCR CTC检测技术检测技术敏感性高敏感性高 I I期肺癌

19、敏感性期肺癌敏感性67.2%67.2%NSCLC患者与对照组的CTC、NSE、CEA、CA125、Cyfra21-1、SCC-AgROC曲线分析不同标志物在NSCLC和I期NSCLC患者中的灵敏度不同标志物在对照组的特异度检测方法cutoff值特异度（%）约登指数I期NSCLC灵敏度（%）AUC（95%CI）CTC8.64/ml84.10.57367.20.823 (0.773-0.874)NSE18 ng/ml95.90.0554.60.585 (0.495-0.675)CEA5 ng/ml94.90.2518.50.76 (0.69-0.83)CA12535 U/ml97.60.1754.

20、60.505 (0.417-0.592)Cyfra21-13.3 ng/ml900.35232.30.716 (0.615-0.816)SCC-Ag1.5 ng/ml93.80.1512.30.624 (0.535-0.713)FR-CTC、NSE、CEA、CA125、Cyfra21-1、SCC-Ag对NSCLC和早期NSCLC患者的诊断效率Yue Yu, et al. Transl Oncol 20131cm1cm肺癌总体敏感性肺癌总体敏感性: : 62.5%62.5%患者编号患者编号CTC Units/3mL病理诊断病理诊断TNM分期分期临床分期临床分期-整理整理nodule diamet

21、er（CT）1 10.53 肺腺癌T1aN0M00.32 0.04 肺腺癌T1N0M00.33 3.83 肺腺癌T1N0M00.54 8.78 肺腺癌tisTis0.55 8.77 肺腺癌T1aN0M00.66 3.93 肺腺癌T1N0M00.77 3.98 肺腺癌T2aN0M00.88 4.84 肺腺癌T1N0M00.89 10.32 肺腺癌T1aN0M0110 13.55 肺鳞癌T1N0M0111 6.29 肺腺癌T1aN0M0112 12.65 肺腺癌T1N0M0113 14.999074肺腺癌T1aN0M00.314 2.5497534肺腺癌T1aN0M00.515 6.2322726

22、肺腺癌T1aN0M00.516 11.312907肺腺癌T1aN0M00.617 14.444199肺腺癌T1aN0M00.618 7.1141741肺腺癌T1aN0M00.719 11.134588肺腺癌T1N0M00.720 11.56小细胞肺癌T2aNxM00.721 13.461248肺腺癌T1aN0M00.722 10.009388肺腺癌T1aN0M00.8肿瘤大小CT特异性（）CTCTC特异性（）30 mm (n134）59.79420-30 mm (n44 )65.995.510-20mm (n69 )55.192.810mm (n21)61.995.2CTC联合CT可以大大提高

23、小结节诊断的特异性CTC辅助CT可以将小结节的判别假阳性率降低到10%Lou JT, Wang L, et al In submission上海市胸科医院：病例一上海市胸科医院：病例一肿瘤标志物肿瘤标志物检测值检测值结果结果正常值正常值CTC10.45CU/3mL10.45CU/3mL升高升高8.7CEA1.29ng/mL正常0-10CYFRA21-13.26ng/mL正常0-3.3NSE13.0ng/mL正常0-20SCCA0.9ng/mL正常0-3CA12511.6U/mL正常35VATS右肺上叶切除术：右肺上叶细支气管肺泡癌（非粘液性），T1aN0M0，直径0.8cm肿瘤标志物肿瘤标志物

24、检测值检测值结果结果正常值正常值CTC13.46CU/3mL13.46CU/3mL升高升高8.7CEA1.03ng/mL正常0-10CYFRA21-12.91ng/mL正常0-3.3NSE2.34ng/mL正常0-20SCCA1.59ng/mL正常0-3VATS右肺上、中叶切除+系统性淋巴结清扫：术后病理确诊：右上叶腺癌（非粘液性）、细支气管肺泡癌及肺泡样混合亚型，高分化， T1aN0M0肿瘤大小：0.5*0.7*0.4cm 上海市胸科医院：病例二上海市胸科医院：病例二FRFR靶向靶向PCR-CTCPCR-CTC检测检测显著优于一般显著优于一般肿瘤标志物：可帮助肺部小结节鉴别肿瘤标志物：可帮助

25、肺部小结节鉴别诊断诊断总结总结 LDCT筛查可降低肺癌死亡率，但也导致部分过度诊疗问题，手术 or 随访？ 目前各种鉴别诊断方法各有利弊 手术活检：创伤大 随访：升期的风险 PET-CT：假阳性率高，1cm无法有效检出 FRFR靶向靶向CTCCTC检测技术检测技术优于一般血清学标志物可帮助优于一般血清学标志物可帮助无无创鉴别诊断肺部小结节创鉴别诊断肺部小结节 I期肺癌敏感度可达68%左右l 目前常规检测肺癌转移和评价治疗效果的方法主要是胸部CTl 胸部胸部CTCT只能评价肿瘤的大小部位，无法评估肿瘤的动态功能只能评价肿瘤的大小部位，无法评估肿瘤的动态功能lFR受体靶向CTCCTC检测做为三倍敏

26、感度的检测做为三倍敏感度的新一代肿瘤标志物新一代肿瘤标志物，敏感度更高，可用，敏感度更高，可用于评估肿瘤发生发展状态。于评估肿瘤发生发展状态。CTCCTC联合胸部联合胸部CTCT， 更全面的评估肿瘤更全面的评估肿瘤胸部胸部CT筛查与过度诊疗的悖论筛查与过度诊疗的悖论液态活检在肺癌中的应用液态活检在肺癌中的应用治疗策略事件肺癌待查辅助诊断早癌肺癌晚期肺癌癌症耐药复发监测治疗方案选择疗效评估耐药机理新药研发CK+ cellsHER-2+ cells第9周的乳腺管组织切片：乳腺管周围非典型性增生第30周的肿瘤组织切片：新生的肿瘤上皮细胞形成牙槽并侵袭周围基质什么时候可以检测到CTC？早期肿瘤外周血中

27、即可检出CTC格诺CytoploRare 灵敏度最高的检测技术l 特异性DNA PCR扩增-提高敏感性l FR靶向：高特异性探针l 1 CTC in 6,000,000（可在600万个背景细胞中检测出一个CTC）CytoploRare FRFR靶向靶向PCR CTCPCR CTC检测检测敏感性试验：敏感性试验：1ctc in 1,200,0001ctc in 1,200,000白细胞白细胞Jiatao Lou, et al. Plos One 2013l 将不同数量的FR阳性肿瘤细胞分别掺入3ml全血(1.2-3.0X107）l FR靶向PCR CTC检测技术的回收率接近100%，且呈线性分布l检测灵敏度约为5.09/（1.23*107）=1/240万600万FRFR靶向靶向PCR CTCPCR CTC检测技术检测技术敏感性高敏感性高 I I期肺癌敏感性期肺癌敏感性67.2%67.2%NSCLC