肉毒梭状芽孢杆菌检测

1、梭状芽孢杆菌 梭状芽孢杆菌属的成员 在自然界中是一种非常 独特的种类，当其进入 到反刍动物体内时，常 会引起肌肉和软组织感 染、肠道疾病和神经中 毒性疾病。梭状芽孢杆 菌引起反刍动物发病的 机理通常是间接地通过 其产生的一种或多种毒 素（毒蛋白质）来致病。 梭状芽孢杆菌 在不同细菌中，芽孢 所处的位置不同，有 的在中部，有的在偏 端，有的在顶端。芽 孢一般呈圆形、椭圆 形、圆柱形。 梭状芽孢杆菌 在有些细菌中，芽孢 的直径小于菌体直径， 这些细菌称为芽孢杆 菌，为好氧细菌；在 另一些细菌中，芽孢 的直径大于菌体直径， 使整个菌体呈梭形或 鼓塑形，这些细菌称 为梭状芽孢杆菌，为 厌氧菌。 肉毒毒

2、素 肉毒毒素 （botulinum toxin，AX） 是肉毒杆菌产生的含有 高分子蛋白的神经毒素， 是目前已知在天然毒素 和合成毒剂中毒性最强 烈的生物毒素，它主要 抑制神经末梢释放乙酰 胆碱，引起肌肉松弛麻 痹，特别是呼吸肌麻痹 是致死的主要原因。 化学结构与理化性质化学结构与理化性质 从1964年由肉毒杆菌中分离出 毒素结晶至今已获得七种（A， B，C，D，E，F和G）类型的毒 素，能引起人员中毒的主要是A、 B和E型毒素，其中以A型军用意 义最大，A型结晶毒素是由19种 氨基酸组成的单一蛋白质，分子 量为90120万，化学结构目前 尚不清楚。肉毒毒素通常是由神 经毒素和血凝素组成的复合

3、形式 存在。A型肉毒毒素的纯品是一 种白色晶体粉末，易溶于水，但 稳定性较差。受热、机械力和氧 的作用而降解。粉末状的毒素可 长期贮存而不失活性，肉毒毒素 染毒的食物和水源，一般其毒性 可保持数天乃至一周，肉毒毒素 不被胃肠液所破坏，易经消化道 中毒。 中毒途径与毒性中毒途径与毒性 A型肉毒毒素的气溶胶对人吸入的 致死量为0.3g，LCt50为0.1 0.5mgmin/m3，静脉注射致死量为 0.150.3g，口服致死剂量为8 10g，该毒素对小鼠的毒性LD50值 约为31053104g。野外试 验表明，由于大规模施放方法尚未解 决，肉毒毒素通过呼吸道中毒的致死 效应，并不比等量神经性毒剂大。

4、当 前以污染食物和水源通过消化道染毒 为其主要的中毒途径。另据报道，美 军利用肉毒毒素污染小型武器的弹头， 以增强杀伤效应，现已生产这种武器。 平时主要是摄入被肉毒毒素污染的肉 类和罐头等食品而中毒，死亡率大约 为2550。 中毒机理中毒机理 业已阐明，在体内肉毒毒素特异性的与胆碱能神 经末梢突触前膜的表面受体相结合，然后由于吸附性 胞饮而内转进入细胞内称为毒素的内转 （internalization），使囊泡不能再与突触前膜融合， 从而有效地阻抑了胆碱能神经介质乙酰胆碱的释 放。与此同时，毒素与突触前膜结合，还阻塞了神经 细胞膜的钙离子通道，从而干扰了细胞外钙离于进入 神经细胞内以触发胞吐和

5、释放乙酰胆碱的能力。乙酰 胆碱释放的抑制，有效地阻断了胆碱能神经传导的生 理功能，尤其是神经一肌肉接头部位特别敏感，引起 全身随意肌松弛麻痹，呼吸肌麻痹是致死的主要原因。 临床表现临床表现 肉毒毒素经消化道吸收中毒，一般经过1272小时的潜伏 期，开始出现全身中毒症状。 早期症状有恶心、呕吐及腹泻等，继之出现头痛、头昏、眩 晕、软弱无力，中毒的重要特征为视力紊乱：复视、斜视、瞳孔 散大、视力模糊，同时伴有眼球震颤，这是眼内外肌麻痹的结果。 严重病人有吞噬、咀嚼、语言、呼吸等困难，排痰及抬头困难， 共济失调等，神志清楚。症状继续发展则出现进行性呼吸困难， 全身肌肉松弛性麻痹。继则脉搏加快，血压下

6、降，短时间抽搐， 意识丧失，最终因呼吸衰竭、心力衰竭或继发肺炎等而死亡。通 过呼吸道吸入中毒，一般症状发展迅速且严重。其他途径中毒的 临床症状，因毒剂的剂量不同而异。病人恢复较缓慢，视觉障碍 恢复特慢，有时需数月之久。 肉毒梭状芽孢杆菌 肉毒梭状芽孢杆菌 （ Clostridium botulinum ）是 可形成芽孢、无荚膜、有鞭毛的 革兰氏阳性杆菌，可产生对人和 动物具有强大毒性的外毒素肉毒 毒素。可分为 A ， B ， C （， ）， D ， E ， F 和 G 7 个血 清型，对人具有不同程度的致病 力。肉毒毒素受高温、碱性条件、 日光直射时均可被破坏而不稳定， 但在酸性条件下较稳定。

7、引起的 中毒是毒素型中毒，毒素作用于 中枢神经系统的颅神经核，抑制 乙酸胆碱的释放，引起肌肉麻痹。 在厌氧的土壤、江河湖海的淤泥 沉积物、尘土和动物粪便中有广 泛存在，易污染蔬菜、鱼类、肉 类、豆类等蛋白质丰富的食品。 肉毒梭状芽孢杆菌 肉毒梭状芽孢杆菌为厌氧性 革兰氏阳性杆菌，罐装食品 中引起腐败的主要菌种，解 糖嗜热梭状芽孢杆菌 （ Cl.thermosaccharolyticum） 可分解糖类引起罐装水果、 蔬菜等食品的产气性变质。 腐败梭状芽孢杆菌 （Cl.putrefaciens）可以引 起蛋白质食物的变质。肉类 罐装食品中最重要的是肉毒 梭状芽孢杆菌 （Cl.botulinum）,

8、其芽孢产 生在菌体的中央或极端，芽 孢耐热性极大，能产生很强 的毒素。 检验所需器材 庖肉培养基、卵黄琼 脂培养基、明胶磷酸 盐缓冲液、肉毒分型 抗毒诊断血清、胰酶、 革兰氏染色液等。 检验所需器材 离心机及离心管、研钵及细砂、培养箱、显微 镜、厌氧培养装置、1ml和10ml吸管、1ml注射 器、平皿、接种环、载玻片、小白鼠等。 肉毒梭菌及肉毒毒素检验 程序 肉毒毒素检测操作方法 检样制备 检出试验 确证试验 毒力测定 定型试验 肉毒梭菌检验 操作方法 样品处理 增菌培养 分离培养 注意事项 典型的肉毒中毒，小白鼠会在46小时内死亡，而且98%99% 的小白鼠会在12小时内死亡，因此，试验前2

9、4小时内的观察是 非常重要的。 24小时后的死亡是可疑的，除非有典型的症状出现。 如果小白鼠注射1：2或1：5倍数的稀释样品后死亡，但注射更高 稀释度的样品后未死亡，这也是费城可以的现象，一般为非特异 性死亡。 小白鼠要用不会抹去的颜料加以标记。 小白鼠的饲料与水应及时添加、充分供应。 食物中发现毒素，表明未经充分的加热处理，可能引起肉毒中毒。 检出肉毒梭菌，但未检出肉毒毒素，不能证明此食物会引起肉毒 中毒。 梭状芽孢杆菌 在有些细菌中，芽孢 的直径小于菌体直径， 这些细菌称为芽孢杆 菌，为好氧细菌；在 另一些细菌中，芽孢 的直径大于菌体直径， 使整个菌体呈梭形或 鼓塑形，这些细菌称 为梭状芽孢杆菌，为 厌氧菌。 化学结构与理化性质化学结构与理化性质 从1964年由肉毒杆菌中分离出 毒素结晶至今已获得七种（A， B，C，D，E，F和G）类型的毒 素，能引起人员中毒的主要是A、 B和E型毒素，其中以A型军用意 义最大，A型结晶毒素是由19种 氨基酸组成的单一蛋白质，分子 量为90120万，化学结构目前 尚不清