不同品种桑叶高效液相指纹图谱的聚类分析

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减不同品种桑叶高效液相指纹图谱的聚类分析（作者：单位：邮编：）作者：游元元 万德光 裴瑾杨文宇【摘要】 目的研究四川地区主流桑树品种桑叶的 HPLC指纹图谱， 并进行聚类分析，探讨品种对桑叶化学成分累积的影响。 方法建立桑 叶的HPLC指纹图谱，对16批样品共有峰峰面积进行聚类。结果不 同品种桑叶相似度均大于 0.90，但所含化学成分的含量存在差异， 相同基原不同品种的桑叶被聚类到了不同类别中。结论桑叶中化学成分的累积与品种有一定相关性。【关键词】桑叶品种高效液相指纹图谱聚类分析中国栽桑养蚕有上千年的历史，每年秋蚕饲养完毕后，桑树所余叶 片即可作为桑叶药材被收

2、购使用，所以桑叶的药用是附属于养蚕业 的。四川是蚕桑大省，随着蚕桑业的发展，近年来四川地区培育了众 多桑树品种，又从外地引进了不少品种推广种植， 故市售的桑叶药材 实际来源于多个品种的桑属植物。尽管大多数桑的栽培品种均源于桑 科植物桑Morus alba L.，桑叶来源符合中国药典规定1，但 不同品种的桑叶之间必然存在质量差异。本研究选取了目前在四川全省推广栽培的多个主流桑树品种，采用高效液相色谱指纹图谱技术，比较了不同品种冬桑叶的指纹图谱， 并 进行了聚类分析，以期为探讨品种对桑叶化学成分累积的影响奠定基 础，为四川地区桑叶药材的质量评价提供参考。1仪器与材料1.1仪器DionexP680型

3、高效液相色谱仪（美国戴安公司），由P680 泵、UVD170U紫外检测器、TCC-100柱温箱、ASI-100自动进样器 及Chromeleon色谱工作站组成。BP1215电子天平（德国赛多利斯 公司，d = 0.1mg ），Rios纯水器（密理博上海贸易有限公司），AS5150BD-I超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。1.2试药甲醇（色谱纯，美国Fisher公司），水为超纯水，其他试剂 均为分析纯（AR）;芦丁对照品（批号10080-200306 ）与绿原酸对 照品（批号110753-200413 ）购自中国药品生物制品检定所。1.3材料桑叶对照药材（批号121123-200302

4、 ）购自中国药品生物 制品检定所，其它样品于20071113从四川省农业科学院蚕业研究 所桑树种质资源圃米集。样品资料见表 1。表1桑叶样品品种1.4数据处理软件采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004A版（国家药典委员会）进行 HPLC图谱的数据分析；应用 SPSS 13.0版进行聚类分析。2方法与结果2.1 色谱条件 色谱柱为 Phe no me nex Lu na C18（2） （250 mm M.6 mm , 5呵）；流动相为甲醇（A）-0.5 %磷酸（B）梯度洗脱，甲醇的 体积变化：010 min 为 14.5% , 10 20 min 为 14.5% -25.5% ,20 28

5、 min 为 25.5% 32% , 28 40 min 为 32% -38.5% , 40 55 min 为 38.5% 49% ;流速 1.0 ml mi n-1 ;检测波长 320 nm ;柱温 30 C； 进样量15血2.2溶液制备2.2.1对照品溶液制备 精密称取对照品绿原酸5.10mg、芦丁 0.85 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。2.2.2供试品溶液制备 取样品粉末（过4号筛）1.0 g,精密称定， 置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇50 ml，称重，浸泡过夜，超声提取 45 min，称重，补足减失重量。过滤，精密量取续滤液25 ml，减压浓缩至近

6、干，残渣用70%甲醇溶解并定容至5 ml，以0.45 呵微孔 滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。2.3方法学考察2.3.1精密度实验取供试品溶液（桐乡青），按已建立的HPLC分 析条件连续进样5次，考察主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的 一致性，其RSD均小于1%。仪器精密度良好。2.3.2重复性实验 取同一供试品（新一之濑）5份，按供试品溶液 的制备和检测方法进行制备并检测，考察主要色谱峰相对保留时间和 相对峰面积的一致性，其 RSD均小于3%，指纹图谱的全貌无明显 变化，符合指纹图谱要求。2.3.3稳定性实验取同一供试品溶液（桐乡青），分别在0, 2, 4, 8, 12, 24, 48

7、h等不同时间点进样分析，考察主要色谱峰相对保留 时间和相对峰面积的一致性，其 RSD均小于3%，表明样品在48 h 内是稳定的。2.4不同品种桑叶的HPLC指纹图谱获取 将16个桑叶样品按照所 建立的方法进行分析，所得色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评 价系统2004A版以中检所购得的对照药材作为指定参照图谱，经 色谱峰匹配，采用中位数法生成对照图谱，通过“相似度计算”功能进 行色谱图谱样本与对照图谱的相似度评价。匹配数据显示，所有样品HPLC图谱共有15个共有峰(见图1与 图2)。通过与对照品比较，样品中的4号峰与12号峰分别被鉴定为 绿原酸与芦丁。在各样品图谱中，4号峰绿原酸的峰面积最大，

8、保留 时间适中，且与相邻色谱峰分离良好，故将其指定为内参照峰。16批样品相似度为0.9150.995，相互吻合程度较高，说明样品 所含化学成分及相对含量比较一致，但共有峰的总峰面积比(样品共有峰总峰面积/所有批次样品共有峰总峰面积的平均值)显示，不同 品种所含化学成分的绝对含量存在差异见图3。2.5不同品种桑叶的HPLC指纹图谱的聚类分析将16个桑叶 样品的15个共有峰峰面积作为特征，采用离差平方和法 (Ward method)，以欧氏距离(Euclidean distanee)对样品聚类，结果见图4。 16个样品聚为4类时，第1类包括S1 ;第2类包括S2，S3，S5， S6，S10，S12

9、，S14，S16 ; 第 3 类包括 S4，S7，S8，S11，S13 ; 第4类包括S9，S15。3讨论供试样品除对照药材外，其它桑叶均在立冬后同时采于四川省农业 科学院蚕业研究所桑树种质资源圃， 采收时间、生长环境影响因素相 同。从聚类结果看，第1类仅有对照药材S1，S1色谱图也显示总峰面 积小于其它样品峰面积。分析原因可能为对照药材产地与其它样品不 同，存放时间较长，弓I起化学成分总量的区别。第2类中S2、S3、S14、S16 基原为 Morus alba Linn.，S12 基原为 Morus alba var. multicaulis ,S5、S6、S10 为杂交桑。第 3 类中 S13 基原为 Morus alba var. multicaulis，S4、S7、S8、S11 为杂交桑。第 4 类中 S9、S15 基原均为Morus alba var. multicaulis。为更好地满足蚕桑业发展需 要，人们不断地改良桑树品种。在繁育栽培过程中，种质、嫁接方式、 树龄等因素都会影响桑叶中化学成分的累积，使同地生长同时采收的相同基原的桑叶被聚类到了不同类别中。15个四川地区主流桑树品种中，以湘7920的桑叶所含化学成分总 量最多，总峰面积比为1.56