分子生物学第一次讨论人类基因组DNA提取、限制性核酸内切酶切割的原理方法琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用

1、第三组 口腔1401班 第一次讨论课第一次讨论课人类基因组人类基因组DNADNA提取、限制性核酸内提取、限制性核酸内切酶切割的原理、方法、琼脂糖凝胶切酶切割的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用。电泳结果分析及其应用。 人类基因组DNA提取可以从外周血，肝或脾组织取材，也可以无创伤的采集材料，如用口腔上皮脱落细胞，发根细胞。提取方法有经典酚醇法、盐析法、煮沸法。 以下以酚醇法提取外周血白细胞DNA为例原理原理l原则保证DNA一级结构的完整。减少细胞内DNase对DNA的降解。排除蛋白质，其他核酸及有机溶剂分子的污染。原理原理lDNA和蛋白质的性质DNA整体表现为酸性，带负电。是极性化合物

2、，微溶于水，不溶于乙醇，苯酚，氯仿，乙醚等有机溶剂，形成沉淀。从而被分离提取出来。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀，从而被除去。l相关试剂及作用细胞裂解液 :82.9g NH4CL，10gKHCO3，0.37gEDTANA2, 灭菌双蒸水定容至1000mL EDTANA2是一种血液抗凝剂低渗溶液使细胞膜涨破，白细胞释放细胞核，红细胞释放血红蛋白 细胞核裂解液(STE)：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol

3、/L EDTA 使核膜破裂，释放染色质 EDTA是一种血液抗凝剂，同时抑制核酸酶活性，防止DNA被水解。RNase是RNA酶，能水解去除DNA中的RNASDS（十二烷基硫酸钠）是一种去污剂，能导致蛋白质变性，成为易溶于水的复合物。从而破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。蛋白酶K是一种很强的蛋白水解酶，在SDS中稳定。水解各种蛋白质（包括糖蛋白和肽类，和脂类，胺类物质）。同时由于RNA酶和DNA酶是蛋白质，也可被水解，从而防止DNA被水解。酚是蛋白质的变性剂，并将变性的蛋白质溶解其中。而DNA则溶解于水相。氯仿也是蛋白质的变性剂，促进两相分离，并除去DNA溶液中的酚。无水乙醇：DNA不溶

4、于其中， 沉淀DNA70%乙醇：溶解其他有机溶剂， 而DNA几乎不溶于其中， 洗涤DNA沉淀。洗涤完后， 乙醇易挥发。l注意事项操作时要戴手套，因为苯酚是腐蚀剂，另外防止手上的核酸酶或细菌污染DNA样品。方法方法加入细胞裂解液和细胞核裂解液，裂解细胞和细胞核，释放染色质加入RNase，SDS,蛋白酶K等，水解RNA和蛋白质酚：氯仿（1:1）分离DNA70%乙醇，漂洗DNA无水乙醇沉淀TE缓冲液溶解DNA。,-20保存。取材。EDTANA2抗凝处理的新鲜全血限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶l定义 限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割

5、的一类酶，简称限制酶。磷酸二酯键l分类 根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子 I类酶在DNA分子上没有特异性的酶解片断 类酶在DNA分子上有特异性的酶解片断原理原理l识别特定的核苷酸序列（识别序列多为回文序列）l在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割切割方法切割方法l生成平末端 有一些酶沿识别序列对称轴切断DNA，产生的末端称为平端或钝端。例如:SmaIl生成粘性末端 切点是交错的,生成两条单链末端的碱基是互补的，切后末端可以粘接起来,称为粘性末端。黏性末端的片段可自行复性,易于通过DNA连接酶把断裂点接上而复原。不同来源的DNA用同一限制性内切酶切后生成的片段由于具有

6、粘性末端可通过氢键互补地粘接,再用DNA连接酶连成重组的DNA分子,因此该酶的发现和应用使基因工程成为可能。如EcoR I 5-G GAATTCAATTC-3 5-G G AATTC AATTC-3 3-CTTAACTTAAG G-5 3-CTTAACTTAA G G-5氢氧化铁胶体在直流电作用下移向阴极，这是大家熟悉的电泳实验现象。后来发展起来可以减少外界干扰的区带电泳技术，这是一种用固体作支持介质的电泳技术，待分离物质通过在支持介质中移动而得以分离成若干区带。如果用琼脂糖凝胶作支持介质，这种区带电泳技术则称为琼脂糖凝胶电泳。在电场作用下，DNA和RNA之类生物大分子可在琼脂糖凝胶中运动。由

7、于分子泳动速率与分子大小和分子构型有关，因而可将不同大小的分子，或分子大小相同但构型不同的分子分离开来。琼脂糖凝胶电泳技术在当代已经成为一种极其重要的分析手段，广泛应用于生物化学、分子生物学、医学、药学、食品、农业、卫生及环保等许多领域。什么是琼脂糖凝胶什么是琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳技术使用琼脂糖凝胶作为固体介质。从海藻提取出的琼脂中可以分离出一种胶状多糖，称为琼脂糖。琼脂糖通常为自色粉末，有时稍带色。它的主要成分为交替连接的D-吡喃半乳糖和3，6-脱水-L-吡喃半乳糖基。琼脂糖分子中含有很多羟基，羟基之间的氢键使琼脂糖分子聚集，成为形成凝胶的主要作用力。琼脂糖形成凝胶的过程如图3所示。在加热

8、条件下，琼脂糖溶于水，形成溶液。当该溶液的温度降至45左右时，多糖链(图3左部)通过链间的氢键形成双螺旋结构(图3中部)。双螺旋之间通过氢键相连成束，束间再通过氢键作用形成三维网络结构(图3右部)，即凝胶36。由于维系三维网状结构的作用力主要是氢键，因此能破坏氢键的因素都能破坏琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶三维网络结构中存在大量微孔，这就是DNA分子在凝胶中移动的通道。在一定的电场强度下，相同构型的DNA分子，在凝胶中的迁移速率与分子量的对数值呈反比关系，因此可以将不同分子量的DNA分开。分子量相同时，不同构型DNA分子的迁移速率也不同，也可以分开。图展示了DNA的3种分子构型。通常，超螺旋DNA的迁

9、移速率最快，线性DNA次之，开环DNA最慢。因此，琼脂糖凝胶电泳技术成为分离、鉴定DNA混合物的常用方法。电泳是如何实现分离DNA的电泳实验过程通常包含4个环节。将琼脂糖在水中加热到90以上使其溶解后，趁热倒入制胶板中，让它在室温下自然凝固，形成半固体状的无色透明凝胶片。这一步称为制胶。制胶板中事前插有梳子，当凝胶形成后，移去梳子，胶片中就留下了小孔。将这样的凝胶片放人电泳槽(图7)，加入电泳液后，向小孔中加入待分离的DNA样品。这一步称为点样，通常的点样量只有几个微升。接通电源，在电场的作用下，DNA分子在凝胶的孔隙中向正极移动，这就是电泳。分子量不同或构型不同的DNA分子的电泳速率不同，因

10、此可以分离开来。由于DNA本身无色，所以需要加入一种有色指示剂，来帮助人们确定它移动到了什么位置。所用指示剂一般分子量很小，电泳速率较快，跑在泳带的最前端，可以根据它的位置及时终止电泳。实验中还需要加入某种荧光染色剂，它与DNA的结合体在紫外光照射下发出荧光，从而将分离出的DNA条带显示出来。图1就是加有荧光染色剂的样品在紫外光下拍摄的照片。将实验样品与DNA标准样品同时电泳，比对2者的条带位置，就可以鉴定分离出的DNA的分子量或构型。琼脂糖凝胶电泳可以：（1）用于DNA切胶回收；（2）用于DNA分离；（3）用于佐证DNA是否重组、质粒等是否切开以及其他分子生物学研究。第一次讨论课第一次讨论课

11、 （2 2）第第3 3组组 口腔口腔14011401班班 原理 方法 注意事项 结果鉴定人类细胞质RNA提取 原理 方法RT-PCR的原理、方法 原理 结果分析 应用琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用人类细胞质人类细胞质RNARNA提取提取 真核细胞总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。 RNA提取实质就是将细胞裂 解，释放RNA，并通过不同方式去除蛋白、DNA等杂质最终获得高纯度RNA产物的过程。AAAAAAAAAAAAtRNAmRNArRNA人类细胞质人类细胞质RNARNA提取

12、提取 RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。在分离RNA的过程中，用抑制剂以抑制RNA酶的活性。 RNA提取对样品的新鲜性要求非常高，获取样品后最好立即提取RNA，若无条件立即实验，应于-80或液氮中保存样品，取出样品后立即在低温下研磨裂解细胞，以防RNA降解。建立一个无RNA酶的环境Trizol法2021-8-3DEPC,焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯 RNA操作时最常用的RNase抑制剂，对核酸酶有很强的抑制作用。作用机制是与蛋白质中的活性基团组氨酸结合，使蛋白质变性。 使用方法：用来去除溶液中的RNase 。RNA提取

13、中 所有液体试剂都应该用DEPC处理。 有效浓度：0.05%-0.1%，室温磁力搅拌20分钟。 灭活条件：高压消毒，或70 C 1 h。 在Tris溶液中半衰期为1.25min。 储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。人类细胞质人类细胞质RNARNA提取提取 Trizol是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物。 异硫氰酸胍可裂解细胞，并使RNA与蛋白质分离。酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。人类细胞质人类细胞质RNARNA提取提取破碎组织分离RNA沉淀RNA融解RNA保存R

14、NA洗涤RNAl 可以用盐酸胍、硫氰酸胍、蛋白酶K等破碎组织l 加入-ME可抑制RNA酶的活性l 一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，离心。RNA分层于上部。l 一般用乙醇、3M NaAc 或异丙醇l 使用70%乙醇洗涤，洗涤后可以晒干或烤干乙醇（但是不能过于干燥，否则不易溶解）人类细胞质人类细胞质RNARNA提取提取u塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。u有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。 u所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6h或更长时间。 u配制的溶液应

15、尽可能用0.1% DEPC在37处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。 RNARNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活人类细胞质人类细胞质RNARNA提取提取u全程佩戴一次性手套。皮肤带有细菌和外源性核糖核酸酶，可能污染RNA。2021-8-34内因：核糖残基的2和3位置带有羟基，易被水解4外因：内源、外源RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活人类细胞质人类细胞质RNARNA提取提取 完整的RNA的电泳可明显地观察到28S和18S两条带，

16、并且28S大约是18S的两倍宽。 若两条带不明显, 则说明RNA部分降解。 人类细胞质人类细胞质RNARNA提取提取RT-PCR RT-PCR 原理及方法原理及方法逆转录逆转录PCRPCR原理及方法原理及方法知识背景基因表达RT-PCR原理简介 RNAcDNA目的目的片段片段PCRRTl实质聚合酶链式反应（PCR）广泛应用的变形.知识背景RT (reverse transcription ）即逆转录，指以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。逆转录过程是RNA病毒的复制形式之一，需逆转录酶的催化。RNA cDNA逆转录RT逆转录酶的选择RNA cDNA逆转录酶逆转录酶（re

17、verse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1.依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；2.Rnase水解活性：由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子；3.依赖DNA的DNA聚合酶活性:以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA链。4.常见的有哺乳动物型,最适温度37度，禽类最适温度42度48RT实验要素-决定反应的特异性和灵敏性* 分离高质量分离高质量RNA * 使用高活性的逆转录酶使用高活性的逆转录酶* 提高逆转录酶保温温度提高逆转录酶保温温度* 减

18、少基因组减少基因组DNA污染污染知识背景PCR (Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异的在体外扩增任何目的的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。PCRRT-PCR方法引物的设计引物特异性决定PCR的特异性A.引物长度:一般为1530bp B.碱基分布:四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在C. 3端要求：3端必须与模板严格互补

19、，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。D.引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列E.引物之间的二级结构F.同源序列。G.5端无严格限制标准的PCR过程分为三步DNA变性 （90-96）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA退火 （50-60）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。延伸 （70-75）：在Taq酶（72左右，活性最佳梯度PCR仪）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3端开始以从53端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链 三步一个循环，以此往复， PCR:PCR的基本流程：的基本流程：94oC, 45 sec55oC, 1 min72o

20、C, 2 min退火温度的变化是根据退火温度的变化是根据引物的引物的GC比例确定或估比例确定或估计的；计的；退火时间的变化是根据退火时间的变化是根据引物的长度调整的。引物的长度调整的。热启动：热启动：避免发夹结构或其避免发夹结构或其他二级结构影响引他二级结构影响引物的退火。物的退火。两种方式加入两种方式加入DNA聚合酶：聚合酶：热启动结束后暂停热启动结束后暂停PCR反应，在反应，在PCR仪仪上直接趁热加入上直接趁热加入DNA pol；热启动结束后将反应管迅速放在冰上，热启动结束后将反应管迅速放在冰上，然后加入然后加入DNA pol。55PCRRT-PCRRNAcDNA目的目的片段片段PCRRTRT-PCR的两种方法RT-PCR的两种方法%二步法RT-PCR的两种方法%一步法RT-PCR两种方法的比较RT-PCR