第三章 微生物细胞的破碎

1、第三章第三章 微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎 微生物微生物 代谢产物代谢产物 胞外产物胞外产物 胞内产物胞内产物 大多数小分子代谢物大多数小分子代谢物 细菌产生的碱性蛋白酶细菌产生的碱性蛋白酶 霉菌产生的糖化酶霉菌产生的糖化酶 大多数酶蛋白大多数酶蛋白 类脂类脂 部分抗生素部分抗生素 分离提取胞内产物时，首先必须将分离提取胞内产物时，首先必须将 细胞破碎，使产物得以释放，才能进一细胞破碎，使产物得以释放，才能进一 步分离、纯化，因此细胞破碎是提取胞步分离、纯化，因此细胞破碎是提取胞 内产物的关键步骤。内产物的关键步骤。 细胞破碎细胞破碎是指选用物理、化学、是指选用物理、化学、 酶或机械的方法

2、来破坏细胞壁或细胞酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞 膜，使胞内物质释放出来的方法。膜，使胞内物质释放出来的方法。 细胞壁的破碎最为关键，这是因为：细胞壁的破碎最为关键，这是因为： 1 1）细胞壁是具有一定刚性和坚韧的物质，）细胞壁是具有一定刚性和坚韧的物质， 起到保护细胞的作用。起到保护细胞的作用。 2 2）细胞壁具有抗机械撞击的作用。）细胞壁具有抗机械撞击的作用。 3.1 细胞壁结构和化学组成细胞壁结构和化学组成 细胞壁的化学组成是非常复杂细胞壁的化学组成是非常复杂 的，它不仅取决于微生物的类型，的，它不仅取决于微生物的类型， 而且还取决于细胞的年龄和生长而且还取决于细胞的年龄和生长 生理学

3、。生理学。 1细菌细菌 细菌的细胞壁经酸性水解后，可得到如下产物：细菌的细胞壁经酸性水解后，可得到如下产物： (1) 肽聚糖肽聚糖 肽聚糖是细胞的主要成分，由下列化学物质肽聚糖是细胞的主要成分，由下列化学物质 组成：组成：N-乙酰葡萄糖胺（乙酰葡萄糖胺（NAG）；）；N-乙酰胞壁乙酰胞壁 酸（酸（NAM）；）；半乳糖胺半乳糖胺(仅在某些细菌中仅在某些细菌中)。 (2) 氨基酸氨基酸 (3) 磷壁质磷壁质 仅在革兰氏阳性菌中存在。仅在革兰氏阳性菌中存在。 (4) 糖糖 (5) 脂质脂质 脂质主要存在于革兰氏阴性菌中。脂质主要存在于革兰氏阴性菌中。 在革兰氏阳性细菌中，细胞壁的主在革兰氏阳性细菌中

4、，细胞壁的主 要成分是肽聚糖，在壁中呈厚度为要成分是肽聚糖，在壁中呈厚度为2020 80nm80nm的均相层。的均相层。 革兰氏阴性细菌的细胞壁较薄革兰氏阴性细菌的细胞壁较薄(10(1025nm)25nm)， 但更加复杂，包括细胞质膜在内共有三层：一个但更加复杂，包括细胞质膜在内共有三层：一个 刚性的肽聚糖内层和一个双层刚性的肽聚糖内层和一个双层( (中间是脂蛋白，中间是脂蛋白， 外层是脂多糖外层是脂多糖) )。 2真菌和酵母 酵母和真菌的细酵母和真菌的细 胞壁，在电子显微镜胞壁，在电子显微镜 下观察呈纤丝状，约下观察呈纤丝状，约 60nm60nm厚，细胞壁的厚厚，细胞壁的厚 度取决于生长条件

5、特度取决于生长条件特 别是碳源的类别。别是碳源的类别。 细胞壁水解后的产物：细胞壁水解后的产物： 糖及其氨基衍生物糖及其氨基衍生物(主要是葡萄糖、甘露糖、半乳糖、主要是葡萄糖、甘露糖、半乳糖、 岩藻糖和葡萄糖胺岩藻糖和葡萄糖胺) 葡聚糖是酵母细胞壁的主要成分葡聚糖是酵母细胞壁的主要成分 (约约30)；甘露糖；甘露糖(约约30)也是重要的成分；几丁质也是重要的成分；几丁质 虽然量较少虽然量较少(约约12)，但是几乎在所有的酵母细，但是几乎在所有的酵母细 胞中都存在。胞中都存在。 氨基酸氨基酸 主要是谷氨酸和天门冬氨酸，存在于蛋白质主要是谷氨酸和天门冬氨酸，存在于蛋白质 中，占细胞壁成分的中，占细

6、胞壁成分的57。 脂质脂质占细胞壁成分的占细胞壁成分的113.5，其含量取决于菌，其含量取决于菌 种类型、培养基组成及其他一些因素。种类型、培养基组成及其他一些因素。 3.2 细胞破碎的方法细胞破碎的方法 破碎细胞的方法很多，但选择破碎细胞的方法很多，但选择 何种方法则取决于破碎的目的和何种方法则取决于破碎的目的和 待破碎生物体的类型。待破碎生物体的类型。 依据细胞的破碎是否外加作用力可分依据细胞的破碎是否外加作用力可分 为为机械法机械法与与非机械法非机械法两大类：两大类： 机械法中高压匀浆器和珠磨机不仅在实验机械法中高压匀浆器和珠磨机不仅在实验 室而且在工业上得到应用，超声波法和非机械室而且

7、在工业上得到应用，超声波法和非机械 法大多处在实验室应用阶段。法大多处在实验室应用阶段。 激光破碎法激光破碎法 高速相向流撞击法高速相向流撞击法 冷冻冷冻-喷射法喷射法 新的破碎方法新的破碎方法 3.2.1 机械方法 为了破碎微生物细胞，常常选择为了破碎微生物细胞，常常选择 机械的方法，因为它们的处理量大，机械的方法，因为它们的处理量大， 破碎速度较快。破碎速度较快。 采用机械方法，在大多数情况下采用机械方法，在大多数情况下 要采取冷却措施，以便除去由于消耗要采取冷却措施，以便除去由于消耗 机械能而产生的过多热量，防止生化机械能而产生的过多热量，防止生化 物质破坏。物质破坏。 一固体剪切方法一

8、固体剪切方法( 珠磨法珠磨法Bead mill) 将细胞在将细胞在 珠磨机中破珠磨机中破 碎被认为是碎被认为是 最有效的一最有效的一 种细胞物理种细胞物理 破碎法。破碎法。 进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、 石英砂、氧化铝等研磨剂（直径石英砂、氧化铝等研磨剂（直径1mm1mm）一起快）一起快 速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相 剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠 液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆

9、液流出从而实现连续操作。液流出从而实现连续操作。 珠磨机的珠磨机的 工作原理工作原理 破碎作用符合一级反应动力学，破碎的程度常用破碎作用符合一级反应动力学，破碎的程度常用 细胞破碎率细胞破碎率() 来表示：来表示： 对于间歇操作：对于间歇操作： ln 1 / (1-R) = Kt （3-1） 对于连续操作：对于连续操作： 1n 1 / (1-R) = K （3-2） 其中其中 = V / qv 式中式中 R-破碎率破碎率()；K-反应速率常数反应速率常数(1/s)； t-破碎时间破碎时间(s)；-平均停留时间平均停留时间(s)； V-破碎室悬浮液体积破碎室悬浮液体积(L)；qv -进料速率进料

10、速率(L/s)。 反应速率常数反应速率常数K与许多操作参数与许多操作参数 有关，如珠体直径、珠体的装量、细有关，如珠体直径、珠体的装量、细 胞浓度、料液性质、搅拌器转速与构胞浓度、料液性质、搅拌器转速与构 型、操作温度等等。型、操作温度等等。 这些参数不仅影响破碎程度，也这些参数不仅影响破碎程度，也 影响破碎所需的能量。影响破碎所需的能量。 影响破碎率的因素：影响破碎率的因素： q 珠体的大小珠体的大小 q 珠体的装量珠体的装量 q 搅拌转速搅拌转速 q 操作温度操作温度 延长研磨时间、延长研磨时间、 增加珠体装量、提高增加珠体装量、提高 搅拌转速和操作温度搅拌转速和操作温度 等可有效提高细胞

11、破等可有效提高细胞破 碎率，但能耗将大大碎率，但能耗将大大 增加。增加。 二高压匀浆法二高压匀浆法 (High-pressure homogenization) 高压匀浆法是高压匀浆法是 大规模细胞破碎的大规模细胞破碎的 常用方法，所用设常用方法，所用设 备是高压匀浆器，备是高压匀浆器， 它由高压泵和匀浆它由高压泵和匀浆 阀组成。阀组成。 在高压匀浆器中，高压室的压力高达几十个在高压匀浆器中，高压室的压力高达几十个MPa， 细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度可达几百细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度可达几百 米。这种高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫米。这种高速喷出的浆液又射

12、到静止的撞击环上，被迫 改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程 中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成 细胞破碎。细胞破碎。 高压匀浆法的原高压匀浆法的原 理是利用高压使细胞理是利用高压使细胞 悬浮液通过针形阀，悬浮液通过针形阀， 由于突然减压和高速由于突然减压和高速 冲击撞击环使细胞破冲击撞击环使细胞破 裂。裂。 在工业规模的细胞破碎中，对在工业规模的细胞破碎中，对 于酵母等难破碎的或高浓度的细胞，于酵母等难破碎的或高浓度的细胞， 常采用多次循环的操作方法。常采用多次循环的操作

13、方法。 破碎的动力学方程可表示为：破碎的动力学方程可表示为： 1n1 / (1-R) = Ktnp (3-3) 式中式中 R-细胞破碎率；细胞破碎率； Kt-与温度等有关的破碎常数；与温度等有关的破碎常数； n-悬浮液通过匀浆器的次数；悬浮液通过匀浆器的次数； p-操作压力；操作压力； -与微生物种类有关的常数。与微生物种类有关的常数。 由破碎的动力学方程可知，影响破碎由破碎的动力学方程可知，影响破碎 的主要因素是的主要因素是压力压力、温度温度和和通过匀浆器的通过匀浆器的 次数次数。 一般说来，增大压力和增加破碎次数一般说来，增大压力和增加破碎次数 都可以提高破碎率，但当压力增大到一定都可以提

14、高破碎率，但当压力增大到一定 程度后对匀浆器的磨损较大。在工业生产程度后对匀浆器的磨损较大。在工业生产 中，通常采用的压力为中，通常采用的压力为5570MPa。 细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁， 不同种类的微生物细胞及同种细胞在不不同种类的微生物细胞及同种细胞在不 同的环境下，其细胞壁的结构不同。同的环境下，其细胞壁的结构不同。 一般说来，酵母菌较细菌难破碎，处一般说来，酵母菌较细菌难破碎，处 于静止状态的细胞较处于快速生长状态于静止状态的细胞较处于快速生长状态 的细胞难破碎，在复合培养基上培养的的细胞难破碎，在复合培养基上培养的 细胞比在简单合成培养基上培养的

15、细胞细胞比在简单合成培养基上培养的细胞 较难破碎。较难破碎。 不宜采用高压匀浆法破碎的微生物细胞不宜采用高压匀浆法破碎的微生物细胞 q易造成堵塞的团状或丝状真菌易造成堵塞的团状或丝状真菌 q较小的革兰氏阳性菌较小的革兰氏阳性菌 q含有包涵体的基因工程菌（包涵体质地坚含有包涵体的基因工程菌（包涵体质地坚 硬，易损伤匀浆阀）硬，易损伤匀浆阀） 高压匀浆法与珠磨法的比较高压匀浆法与珠磨法的比较 1 1）高压匀浆法操作参数少，易于确定，适合于）高压匀浆法操作参数少，易于确定，适合于 大规模操作；珠磨法操作参数多，一般凭经大规模操作；珠磨法操作参数多，一般凭经 验估计。珠磨机连续操作时兼具破碎和冷却验估

16、计。珠磨机连续操作时兼具破碎和冷却 双重功能，减少了产物失活的可能性，而高双重功能，减少了产物失活的可能性，而高 压匀浆需配备换热器进行级间冷却；压匀浆需配备换热器进行级间冷却； 高压匀浆法与珠磨法的比较高压匀浆法与珠磨法的比较 2）珠磨法破碎在适当条件下一次操作即）珠磨法破碎在适当条件下一次操作即 可达到较高的破碎率，而高压匀浆往可达到较高的破碎率，而高压匀浆往 往需循环往需循环24次才行；次才行； 3）珠磨机适合于各种微生物细胞的破碎，）珠磨机适合于各种微生物细胞的破碎， 而高压匀浆不适合于丝状真菌及含有而高压匀浆不适合于丝状真菌及含有 包涵体的基因工程菌。包涵体的基因工程菌。 三超声破碎

17、法超声破碎法 (Ultra sonication) 超声破碎也是应超声破碎也是应 用较多的一种细胞破用较多的一种细胞破 碎法，通常采用的超碎法，通常采用的超 声破碎机的工作频率声破碎机的工作频率 为为1525kHz。 超声破碎机理超声破碎机理-超声波引起超声波引起空穴现象空穴现象 在相当高的输入声能下，液体各个成核在相当高的输入声能下，液体各个成核 部位会形成许多小气泡。在声波膨胀相中，部位会形成许多小气泡。在声波膨胀相中， 这些气泡会增大，而在压缩相中气泡会被压这些气泡会增大，而在压缩相中气泡会被压 缩，直到不能再压缩时，气泡破裂，释放出缩，直到不能再压缩时，气泡破裂，释放出 猛烈的震波。于

18、是，大量声能被转化成弹性猛烈的震波。于是，大量声能被转化成弹性 波形式的机械能，引起局部的剪切梯度使细波形式的机械能，引起局部的剪切梯度使细 胞破碎。胞破碎。 在用于细胞破碎的容器中，流体动力学在用于细胞破碎的容器中，流体动力学 按照完全混合方式，则蛋白质释放动力学遵按照完全混合方式，则蛋白质释放动力学遵 循一级反应定律：循一级反应定律： 1 x = exp （-kt） (3-4) 式中式中x为释放蛋白质的分率；为释放蛋白质的分率； k为蛋白质释放常数，为蛋白质释放常数，min-1； t为超声波发射时间，为超声波发射时间，min。 超声破碎的效率与声频、声能、超声破碎的效率与声频、声能、 处理

19、时间、细胞浓度及菌种类型等处理时间、细胞浓度及菌种类型等 因素有关。因素有关。 对不同菌种的发酵液，超声破碎对不同菌种的发酵液，超声破碎 的效果差别较大。一般地，杆菌比球的效果差别较大。一般地，杆菌比球 菌较易破碎，革兰氏阴性细菌细胞比菌较易破碎，革兰氏阴性细菌细胞比 革兰氏阳性细菌细胞较易破碎，对酵革兰氏阳性细菌细胞较易破碎，对酵 母菌的效果较差。母菌的效果较差。 采用超声破碎法处理少量样品时操采用超声破碎法处理少量样品时操 作简便，液量损失少，因而在实验室规作简便，液量损失少，因而在实验室规 模应用较为普遍。模应用较为普遍。 超声破碎法的优点超声破碎法的优点 超声波振荡易引起温度的剧烈上升

20、，超声波振荡易引起温度的剧烈上升， 操作时常在细胞悬浮液中加入冰块或在操作时常在细胞悬浮液中加入冰块或在 夹套中通入冷却剂进行冷却。但在大规夹套中通入冷却剂进行冷却。但在大规 模操作中，声能传递和散热均比较困难。模操作中，声能传递和散热均比较困难。 此外，超声波产生的化学自由基团此外，超声波产生的化学自由基团 能使某些敏感性活性物质失活，因而有能使某些敏感性活性物质失活，因而有 一定的局限性。一定的局限性。 超声破碎法的缺点超声破碎法的缺点 四四X-press法法 X-press法是将浓缩的菌体悬浮液冷却法是将浓缩的菌体悬浮液冷却 至至-25形成冰晶体，利用形成冰晶体，利用500MPa以上的高

21、以上的高 压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。 细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰 中的微生物变形而引起的。中的微生物变形而引起的。 此法主要用于实验室，具有适应范围广、此法主要用于实验室，具有适应范围广、 破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留 率高等优点，但该法不适用于对冷冻敏感的率高等优点，但该法不适用于对冷冻敏感的 生化物质。生化物质。 3.2.2 非机械法非机械法 许多非机械方法都适用于微生物细许多非机械方法都适用于微生物细 胞的破碎，包括酶解、渗透压冲击、冻胞的破

22、碎，包括酶解、渗透压冲击、冻 结和融化、热处理、化学法溶胞等，其结和融化、热处理、化学法溶胞等，其 中有些方法的应用是有限制的。中有些方法的应用是有限制的。 一酶溶法一酶溶法(Enzymatic lysis) 酶溶法是利用酶反应分解破坏细酶溶法是利用酶反应分解破坏细 胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目 的。的。 酶溶法可分为酶溶法可分为外加酶法外加酶法和和自溶法自溶法 两种。两种。 1外加酶法外加酶法 常用的溶酶有溶菌酶、常用的溶酶有溶菌酶、-1,3-1,3-葡葡 聚糖酶、聚糖酶、-1,6-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、葡聚糖酶、蛋白酶、 甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶

23、、壳甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳 多糖酶等，而细胞壁溶解酶是几种酶多糖酶等，而细胞壁溶解酶是几种酶 的复合物。的复合物。 利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞 壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定 相应的次序。相应的次序。 实例：实例： 对酵母细胞采用酶溶法破碎时，先加入蛋对酵母细胞采用酶溶法破碎时，先加入蛋 白酶作用蛋白质白酶作用蛋白质- -甘露聚糖结构，使二者溶解，甘露聚糖结构，使二者溶解， 再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后 只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变只剩下原

24、生质体，这时若缓冲液的渗透压变 化，则细胞膜破裂，释出胞内物质。化，则细胞膜破裂，释出胞内物质。 外加酶法主要用于实验室规模，如外加酶法主要用于实验室规模，如 利用酶溶法可从细胞内不同位置选择性利用酶溶法可从细胞内不同位置选择性 地释放目的产物和制取特殊的胞壁葡聚地释放目的产物和制取特殊的胞壁葡聚 糖聚合物等。糖聚合物等。 此外，酶溶法大量用来剥离细胞壁，此外，酶溶法大量用来剥离细胞壁， 将原生质体进行融合，这是细胞工程常将原生质体进行融合，这是细胞工程常 用的方法。用的方法。 选择性释放产物，条件温和，核选择性释放产物，条件温和，核 酸泄出量少，细胞外形完整。酸泄出量少，细胞外形完整。 酶溶

25、法的优点酶溶法的优点 1 1）溶酶价格高，限制了大规模应用；）溶酶价格高，限制了大规模应用； 2 2）酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同）酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同 的酶，且不易确定最佳的溶解条件；的酶，且不易确定最佳的溶解条件； 3 3）产物抑制的存在，在溶酶系统中，甘露）产物抑制的存在，在溶酶系统中，甘露 糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡 聚糖酶，这是导致酶溶法胞内物质释放聚糖酶，这是导致酶溶法胞内物质释放 低的一个重要因素。低的一个重要因素。 酶溶法的不足酶溶法的不足 2自溶法自溶法 自溶法自溶法是一种特殊的酶溶方式，是一种特殊的酶溶方式， 其

26、所需的溶胞酶是由微生物本身产生其所需的溶胞酶是由微生物本身产生 的。的。 控制一定条件，可以诱发微生物控制一定条件，可以诱发微生物 产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶 的活力，以达到细胞自溶的目的。的活力，以达到细胞自溶的目的。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、影响自溶过程的主要因素有温度、时间、 pH、激活剂等。微生物细胞的自溶法常采、激活剂等。微生物细胞的自溶法常采 用用加热法加热法或或干燥法干燥法。 实例：实例： 对谷氨酸生产菌，可加入对谷氨酸生产菌，可加入0.028mol/L 0.028mol/L NaNa2 2COCO3 3和和0.018mol/L

27、NaHCO0.018mol/L NaHCO3 3，配成，配成pHl0pHl0的的 缓冲液，再配缓冲液，再配3 3的细胞悬浮液，加热至的细胞悬浮液，加热至 7070，保温搅拌，保温搅拌20min20min，菌体即自溶。，菌体即自溶。 1 1）对不稳定的微生物，易引起所需）对不稳定的微生物，易引起所需 蛋白质的变性；蛋白质的变性； 2 2）自溶后细胞悬浮液粘度增大，过）自溶后细胞悬浮液粘度增大，过 滤速率下降。滤速率下降。 自溶法的缺点自溶法的缺点 二化学渗透法二化学渗透法 (Chemical permeation) 某些化学试剂，如有机溶剂、表面活某些化学试剂，如有机溶剂、表面活 性剂、抗生素、

28、金属螯合剂等，可以改变性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变 细胞壁或膜的通透性细胞壁或膜的通透性( (渗透性渗透性) )，从而使胞，从而使胞 内物质有选择地渗透出来，这种处理方式内物质有选择地渗透出来，这种处理方式 称为称为化学渗透法化学渗透法。 1. 表面活性物质表面活性物质 表面活性剂可促使细胞某些组分溶表面活性剂可促使细胞某些组分溶 解，其增溶作用有助于细胞的破碎。解，其增溶作用有助于细胞的破碎。 Triton X-100是一种非离子型表面活是一种非离子型表面活 性剂，能结合并溶解磷脂，因此其作用性剂，能结合并溶解磷脂，因此其作用 主要是破坏内膜的磷脂双分子层，从而主要是破坏内膜的磷脂双

29、分子层，从而 使某些胞内物质释放出来。使某些胞内物质释放出来。 2. EDTA螯合剂螯合剂 EDTA螯合剂螯合剂对革兰氏阴性菌细胞外对革兰氏阴性菌细胞外 层膜有破坏作用。层膜有破坏作用。 革兰氏阴性菌的外层膜结构通常靠二革兰氏阴性菌的外层膜结构通常靠二 价阳离子价阳离子CaCa2+ 2+或 或MgMg2+ 2+结合脂多糖和蛋白质 结合脂多糖和蛋白质 来维持，一旦来维持，一旦EDTAEDTA将将CaCa2+ 2+或 或MgMg2+ 2+螯合，大 螯合，大 量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜 出现洞穴，细胞通透性增强。出现洞穴，细胞通透性增强。 3. 有机溶剂

30、有机溶剂 能分解细胞壁中的类脂。能分解细胞壁中的类脂。 把相当于细胞量10的甲苯加到细胞 悬浮液中，由于甲苯被吸收进细胞壁的 类脂中，使胞壁膜溶胀，进而使细胞破 碎，胞内物质被释放出来。 除甲苯外，苯对类脂的分解作用也十 分强，但由于较易挥发和较大的毒性而 很少应用。 根据各种试剂的不同作用根据各种试剂的不同作用 机理，将几种试剂合理地搭配机理，将几种试剂合理地搭配 使用能有效地提高胞内物质的使用能有效地提高胞内物质的 释放率。释放率。 化学渗透法的优点化学渗透法的优点 q 对产物释放具有一定选择性。控制条对产物释放具有一定选择性。控制条 件可以有选择地释放出位于细胞内不件可以有选择地释放出位

31、于细胞内不 同部位的产物。同部位的产物。 q 细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘 度低，易于固液分离和进一步提取。度低，易于固液分离和进一步提取。 q 通用性差，某种试剂只能作用于某些通用性差，某种试剂只能作用于某些 特定类型的细胞。特定类型的细胞。 q 时间长，效率低，一般胞内物质释放时间长，效率低，一般胞内物质释放 率不超过率不超过5050。 q 有些化学试剂有毒性，在其后的产物有些化学试剂有毒性，在其后的产物 提取精制过程中，需设法分离除去。提取精制过程中，需设法分离除去。 化学渗透法的缺点化学渗透法的缺点 三渗透压法三渗透压法 (Osmotic press

32、ure) 渗透压法渗透压法 将细胞放在高渗透压的介将细胞放在高渗透压的介 质中，达平衡后，转入到渗透压低的缓冲质中，达平衡后，转入到渗透压低的缓冲 液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水 迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破 碎。于是，细胞内容物就释放出来。碎。于是，细胞内容物就释放出来。 细胞壁较脆弱的细胞 细胞壁预先用酶处理 在培养过程中加入某些抑制剂(如 抗生素等)，使细胞壁有缺陷 渗透压法适用范围渗透压法适用范围 四反复冻结四反复冻结-融化法融化法 将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下

33、 缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。 由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结 构破裂，从而增加细胞的亲水性能；另一方 面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化， 引起细胞膨胀而破裂。 反复冻结反复冻结-融化法只适用于细胞壁较融化法只适用于细胞壁较 脆弱的菌体，破碎率较低，常需反复多次。脆弱的菌体，破碎率较低，常需反复多次。 此外，在冻融过程中可能引起某些蛋此外，在冻融过程中可能引起某些蛋 白质变性。白质变性。 五干燥法五干燥法 常用的使细胞干燥的方法有：气常用的使细胞干燥的方法有：气 流干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻流干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻 干燥等。干燥等。

34、通过干燥使细胞壁膜的结合水分丧通过干燥使细胞壁膜的结合水分丧 失，从而改变细胞的渗透性。当采用失，从而改变细胞的渗透性。当采用 丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进 行处理时，胞内物质就被抽提出来。行处理时，胞内物质就被抽提出来。 气流干燥气流干燥主要适用于酵母菌，一般 在2530下的气流中吹干，然后用缓 冲液抽提。 真空干燥真空干燥多用于细菌。 冷冻干燥冷冻干燥适用于较不稳定的生化物 质，将冷冻干燥后的菌体在冷冻条件 下磨成粉，然后用缓冲液抽提。 干燥法条件变化剧烈，容易引起蛋干燥法条件变化剧烈，容易引起蛋 白质变性。白质变性。 提取不稳定生化物质时，常加某些提取

35、不稳定生化物质时，常加某些 试剂进行保护，如半胱氨酸、巯基乙醇试剂进行保护，如半胱氨酸、巯基乙醇 和亚硫酸钠等还原剂。和亚硫酸钠等还原剂。 若提取产物在细胞质内，需用机械破碎法；若提取产物在细胞质内，需用机械破碎法； 若在细胞膜附近则可用较温和的非机械法；若在细胞膜附近则可用较温和的非机械法； 若提取的产物与细胞膜或壁相结合时，可采若提取的产物与细胞膜或壁相结合时，可采 用机械法和化学法相结合的方法，以促进产物溶用机械法和化学法相结合的方法，以促进产物溶 解度的提高或缓和操作条件，但保持产物的释放解度的提高或缓和操作条件，但保持产物的释放 率不变。率不变。 选择破碎方法的一般原则选择破碎方法的

36、一般原则 细胞破碎方法的研究方向细胞破碎方法的研究方向 多种破碎方法相结合；多种破碎方法相结合； 与下游过程相结合，必须从后分离过程与下游过程相结合，必须从后分离过程 的整体来考虑破碎操作，即破碎过程要的整体来考虑破碎操作，即破碎过程要 易于细胞碎片的除净；易于细胞碎片的除净； 与上游过程相结合，细胞的培养过程及与上游过程相结合，细胞的培养过程及 其环境条件对细胞的结构及破碎难易有其环境条件对细胞的结构及破碎难易有 很大影响。很大影响。 3.3 破碎率的评价破碎率的评价 破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细 胞数量的百分比数，即： Y() (N0-N)/N0100 N0：原始细胞数量 N：经t

37、时间操作后保留下来的未损 害完整细胞数量。 直接计数法直接计数法 直接对适当稀释后的样品进行直接对适当稀释后的样品进行 计数，可以通过平板计数技术或在血计数，可以通过平板计数技术或在血 球细胞器上用显微镜观察来实现最终球细胞器上用显微镜观察来实现最终 染色细胞的计数。染色细胞的计数。 (2) 间接计数法间接计数法 间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮 液中细胞释放出来的化合物的量液中细胞释放出来的化合物的量(可溶性蛋可溶性蛋 白、酶等白、酶等)。 破碎率可通过被释放出来化合物的量破碎率可通过被释放出来化合物的量R 与所有细胞的理论最大释放量与所有细胞的理论最大释

38、放量Rm之比进行之比进行 计算。计算。 间接计数法最常用的细胞内含物是蛋间接计数法最常用的细胞内含物是蛋 白质，特别是酶活性释放到基质中，是破白质，特别是酶活性释放到基质中，是破 碎程度很好的指示参数。碎程度很好的指示参数。 3.4 包涵体的分离和蛋白质复性 很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基 因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长 激素、白细胞介素激素、白细胞介素-6-6、人、人-干扰素等）不干扰素等）不 仅不能分泌到细胞外，而且在细胞内凝聚成仅不能分泌到细胞外，而且在细胞内凝聚成 没有生物活性的固体颗粒没有生物活性的固

39、体颗粒包涵体包涵体。 包涵体颗粒直径约包涵体颗粒直径约0.13.0m，随表达，随表达 产物而异。较大的包涵体可在相差显微镜产物而异。较大的包涵体可在相差显微镜 下观察到，呈现深色的点，所以包涵体又下观察到，呈现深色的点，所以包涵体又 称称光折射体光折射体。 包涵体主要由蛋白质构成，其中大部包涵体主要由蛋白质构成，其中大部 分是基因表达产物。这些基因表达产物的分是基因表达产物。这些基因表达产物的 一级结构是正确的，但立体结构是错误的，一级结构是正确的，但立体结构是错误的， 所以没有生物活性。所以没有生物活性。 一包涵体的形成 分析表明，包涵体内除表达产物外，分析表明，包涵体内除表达产物外， 还含有微量的质粒、还含有微量的质粒、rRNA和和RNA聚合聚合 酶。酶。 同时，包涵体内的表达产物具有部同时，包涵体内的表达产物具有部 分二级结构。分二级结构。 包涵体形成的几种可能性：包涵体形成的几种可能性： 少量蛋白产生时是可溶的，其后积少量蛋白产生时是可溶的，其后积 聚的量过多，在细胞内超过其溶解聚的量过多，在