电泳分离PPT课件

1、+ 迁移率与迁移率与内在特性内在特性和和外界条件外界条件有关有关内在特性内在特性：颗粒性质（净电荷量，颗粒大小、形状）：颗粒性质（净电荷量，颗粒大小、形状）外界条件外界条件：电场强度、溶液性质、支持体特性：电场强度、溶液性质、支持体特性带电粒子在单位时间内移动的距离称为带电粒子在单位时间内移动的距离称为电泳迁移率电泳迁移率。影响迁移率的因素：影响迁移率的因素：1）颗粒性质：）颗粒性质： Q越大、越大、r 越小、形状越接近球形，越小、形状越接近球形，v 越快。越快。2）电场强度：）电场强度：每厘米距离的电压差，每厘米距离的电压差，E越高，越高，v越快。越快。 常压电泳常压电泳 E：210V/cm

2、 电压：电压：100500V， 大分子物质分离大分子物质分离 高压电泳高压电泳 E：20200V/cm 电压电压 500V， 小分子物质分离小分子物质分离3）溶液性质：）溶液性质： pH值：值：影响粒子所带净电荷量的多少，离影响粒子所带净电荷量的多少，离pI越远，越远，v越快。越快。 （用（用buffer保持恒定）保持恒定） 离子强度：离子强度越高，离子强度：离子强度越高，v 越低。越低。 通常，缓冲液离子强度在通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。之间。4）电渗：）电渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。 应避免用高电渗物质作支持介质。应避

3、免用高电渗物质作支持介质。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳：从琼脂中精制分离出的胶状多从琼脂中精制分离出的胶状多糖，糖，一般用于核酸的分离分析。一般用于核酸的分离分析。（1）琼脂糖凝胶孔径较小，具有分子筛效应；）琼脂糖凝胶孔径较小，具有分子筛效应；（2）机械强度高：可以在浓度）机械强度高：可以在浓度1%以下使用；以下使用；（3）无毒；）无毒；（4）染色、脱色程序简单，背景色较低；）染色、脱色程序简单，背景色较低；（5）热可逆性；）热可逆性；（6）生物中性：一般不与生物材料结合。）生物中性：一般不与生物材料结合。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳： 可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率可用

4、于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率较高。较高。聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺和和琼脂糖琼脂糖是目前实验室最常用的两种支持是目前实验室最常用的两种支持介质。介质。 3. 电泳常用设备电泳常用设备 （1）电泳仪）电泳仪 ：为电泳提供稳定直流电源的装置为电泳提供稳定直流电源的装置 。 常压电泳仪常压电泳仪（600V600V） 高压电泳仪高压电泳仪（3000V3000V） 超高压电泳仪超高压电泳仪（30000V30000V50000V50000V）（2 2）电泳槽：）电泳槽： 自由界面电泳槽自由界面电泳槽 管状电泳槽管状电泳槽 板状电泳槽板状电泳槽（3 3）附属设备：）附属设备： 外循环恒温系统外循环恒温

5、系统:高电压会产生高热，需冷却。高电压会产生高热，需冷却。 灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子。灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子。 1.原理原理 聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体丙烯酰胺单体（acrylamideacrylamide，简称，简称AcrAcr）和交联剂）和交联剂N N，N-N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamidemethylane bisacrylamide，简称简称BisBis）在）在催化剂催化剂和和加速剂加速剂作用下聚合的。作用下聚合的。CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CHCH2 2=CH=CH C=O C=O

6、 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH- C=O C=O C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NH NH2 2 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH- C=O C=O C=O C=O NH NH NH NH2 2丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺（1）催化剂和加速剂的浓度：）催化剂和加

7、速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在聚合过程在4060分钟内完成。分钟内完成。（2）系统）系统pH值：值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果。值，以获得最佳的聚合结果。（3）温度：）温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊，适当提高温度低温下聚合导致凝胶变脆和混浊，适当提高温度可以使凝胶透明而有弹性。可以使凝胶透明而有弹性。（4）分子氧：）分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合

8、；抽气。分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气。（5）系统纯度：）系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合。金属离子会影响凝胶的聚合。 v 影响丙烯酰胺聚合的主要因素影响丙烯酰胺聚合的主要因素 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1 1）化学催化系统：）化学催化系统：AP-TEMEDAP-TEMED 催化剂：催化剂：过硫酸铵过硫酸铵（ammonium persulfateammonium persulfate，APAP） 加速剂：加速剂：TEMEDTEMED（N N，N N，NN，N-N-四甲基乙二胺）四甲基乙二胺）2 2）光催化系统：核黄素光）光催化系统：核黄素

9、光 催化剂催化剂: : 核黄素（维生素核黄素（维生素B B2 2） 引发剂引发剂: : 光光 TEMEDTEMED的存在，可加速聚合。的存在，可加速聚合。 .凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表2. 分离效应分离效应 连续电泳（连续电泳（continuous electrophoresis） 采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（不连续电泳（discontinuous electrop

10、horesis） 采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系 电荷效应电荷效应不连续不连续PAGE PAGE 分子筛效应分子筛效应 浓缩效应浓缩效应 连续连续PAGEPAGE1）电荷效应电荷效应: 分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。2）分子筛效应：分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。3 3）浓缩效应：浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再使样品在浓缩胶中被浓缩成

11、一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。进入分离胶进行分离。在直流电场作用下电泳情在直流电场作用下电泳情况示意图况示意图图中图中A，B，C均为阴离子均为阴离子分子量大小依次为分子量大小依次为MA=MBMC，所带电荷量相同所带电荷量相同QA=QB=QC。8.38.38.96.7三、三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE）简称）简称SDS PAGE。 是目前测定蛋白质亚基相对分子量是目前测

12、定蛋白质亚基相对分子量（relative molecular mass, Mrrelative molecular mass, Mr）的一种最）的一种最好的办法好的办法 。 SDS-PAGE separates proteins by MW1.1.原理：原理： SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。的差异。 SDSSDS破坏蛋白质氢键、疏

13、水键，巯基乙醇使二硫键打开，破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质引起蛋白质构象改变，使蛋白质SDSSDS复合物形状近似椭复合物形状近似椭圆形，短轴相同（圆形，短轴相同（1.8nm1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。），长轴与蛋白质分子量成正比。 因此，因此，蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物(SDS-denatured protein)在在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。 两者关系：两者关系：2. 操作：操作：（SDS-

14、PAGE及及PAGE，即变性及非变性），即变性及非变性）1）制胶制胶: （变性：（变性：buffer 中加中加0.4%SDS） a. 分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液：的分离胶（查表），配制分离胶溶液： Acr:Bis=29:1，分离胶，分离胶buffer, TEMED, AP, 水水 迅速倒胶，加水使液面平坦，室温迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。聚合完全。 b. 浓缩胶：用浓缩胶浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。插上梳子。2）样品制备：样品制备： a. PAGE: 样品样品缓冲液（蔗

15、糖或甘油指样品样品缓冲液（蔗糖或甘油指示剂溴酚蓝）示剂溴酚蓝） b. SDS-PAGE: 样品样品缓冲液（样品样品缓冲液（SDS，甘油，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸25min， 以除去亚稳以除去亚稳态聚合。态聚合。3）加样及电泳：加样及电泳： SDS-PAGE: 电极电极buffer中加中加0.1%SDS，溴酚蓝，溴酚蓝距下端距下端1cm时停止电泳。时停止电泳。4）固定及）固定及染色染色a.a.固定固定：将凝胶浸于：将凝胶浸于7 7乙酸或乙酸或12.512.5三氯乙三氯乙 酸（酸（TCATCA）中固定蛋白质组分。）中固定蛋白质组分。b.b.染色染色： 考马斯亮蓝染色法

16、考马斯亮蓝染色法 银染法银染法（灵敏度比前者高（灵敏度比前者高100100倍）倍） 其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸过碘酸SchiffSchiff试剂（糖蛋白）。试剂（糖蛋白）。四、等电聚焦四、等电聚焦 l 利用蛋白质具有不同等电点的特性，利用蛋白质具有不同等电点的特性，一种含有一种含有各种连续各种连续 pI 的小分子混合物的小分子混合物等电聚焦电泳（等电聚焦电泳（IEF-PAGE）。）。 两性电解质载体在电场作用下，按各自两性电解质载体在电场作用下，按各自pIpI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pHpH梯度

17、。蛋白质在此梯度。蛋白质在此pHpH梯度凝胶中泳动，当迁移梯度凝胶中泳动，当迁移至至pHpH值等于值等于pIpI处时不再泳动，被浓缩成狭窄的处时不再泳动，被浓缩成狭窄的区带。区带。两性电解质载体两性电解质载体(carrier ampholytes)(carrier ampholytes)(1)(1)易溶于水，有足够的缓冲能力易溶于水，有足够的缓冲能力以便保以便保 持稳定的持稳定的pHpH梯度。梯度。(2)(2)导电性能好导电性能好以保持电场强度的均匀性。以保持电场强度的均匀性。(3)(3)分子量小分子量小电泳后易分离除去。电泳后易分离除去。(4)(4)化学组成不同于蛋白质化学组成不同于蛋白质不

18、干扰测定。不干扰测定。(5)(5)与样品中各组分不发生化学反应。与样品中各组分不发生化学反应。pH梯度的形成梯度的形成两性电解质在溶液中的行为可从两方面看，一方面溶液的两性电解质在溶液中的行为可从两方面看，一方面溶液的pHpH决定它带电荷的性质。如溶液是决定它带电荷的性质。如溶液是pH7pH7，对，对pI=9pI=9的两性电解质来的两性电解质来说，是处于酸性环境，故带正电荷；但对说，是处于酸性环境，故带正电荷；但对pI=3pI=3的两性电解质的两性电解质来说，却是处于碱性环境，故而带负电荷。所以，不同来说，却是处于碱性环境，故而带负电荷。所以，不同pIpI的的两性电解质，在同一环境中带有不同性

19、质和数量的电荷；两性电解质，在同一环境中带有不同性质和数量的电荷；另一方面，溶液中的两性电解质又破坏了水的解离平衡：使另一方面，溶液中的两性电解质又破坏了水的解离平衡：使溶液溶液pHpH有所改变。当某一两性电解质有所改变。当某一两性电解质pIpI较低，即释放质子较低，即释放质子(H+)(H+)能力较强，使溶液能力较强，使溶液pHpH值下降，这类两性电解质称为酸性值下降，这类两性电解质称为酸性两性电解质；反之，两性电解质；反之，pIpI高的可使溶液高的可使溶液pHpH值上升，称为碱性两值上升，称为碱性两性电解质。性电解质。所以，在溶液中的两性电解质一方面受溶液所以，在溶液中的两性电解质一方面受溶

20、液pHpH值的影响，决值的影响，决定其带电的性质；另一方面，它又影响周围环境定其带电的性质；另一方面，它又影响周围环境( (水溶液水溶液) )，使其使其pHpH值有所改变。值有所改变。 2. 操作：操作： 1）凝胶凝胶 配制：配制：凝胶浓度凝胶浓度T为为57.5（C=3% 左右）左右） 2）加样：加样：任意位置任意位置 3）电泳：电泳：要求开始电泳时恒压要求开始电泳时恒压60V60V，15min15min，目的在于使小分，目的在于使小分子的，泳动快的载体两性电解质可在短时间内形成一个粗略的子的，泳动快的载体两性电解质可在短时间内形成一个粗略的pHpH梯度。此后，恒流为梯度。此后，恒流为8mA8

21、mA，是为了避免电泳开始时介质中带电颗，是为了避免电泳开始时介质中带电颗粒较多，电泳电流过高而破坏凝胶。当各种蛋白质逐渐泳动到各粒较多，电泳电流过高而破坏凝胶。当各种蛋白质逐渐泳动到各自等电点位置时，带电颗粒逐渐减少，出现电阻增大，电压随之自等电点位置时，带电颗粒逐渐减少，出现电阻增大，电压随之增高现象。当电压升到增高现象。当电压升到550V550V时，带电颗粒已大为减少，电流不再时，带电颗粒已大为减少，电流不再偏高，故恒压到偏高，故恒压到580V580V，继续电泳，继续电泳120min120min后，蛋白质颗粒慢慢地集后，蛋白质颗粒慢慢地集中到它等电点位置。电流接近于零时，蛋白质颗粒不再泳动，电中到它等电点位置。电流接近于零时，蛋白质颗粒不再泳动，电泳也到此结束。泳也到此结束。 4）固定及染色：固定及染色：TCA固定，考马斯亮蓝染色。固定，考马斯亮蓝染色。5）等电点测定：等电点测定： Marker与未知样与未知样品同时电泳染色后，品同时电泳染色后，以以pH值为纵轴，距阴值为纵轴，距阴极距离为横轴，做极距离为横轴，做pH梯度标准曲线，据未梯度标准曲线，据未知蛋白迁移距离可推知蛋白迁移距离可推知知pI。