蛋白质实验技术

1、蛋白质实验技术 杨琳（明理楼107） 课程介绍 n选修课 选修课（选修课（34学时，学时，216） 期末考试闭卷笔答期末考试闭卷笔答 成绩合算期末成绩合算期末0.5平时平时 0.25+论文论文/上课讲解上课讲解 自编讲义自编讲义 课程内容： n介绍蛋白质性质、表达、分离、纯化以介绍蛋白质性质、表达、分离、纯化以 及鉴定过程中所涉及到的基本技术的基及鉴定过程中所涉及到的基本技术的基 本原理、应用范围及注意事项。本原理、应用范围及注意事项。 主要参考书： 1生物化学面向生物化学面向21世纪课程教材世纪课程教材（第三版）（第三版） 王王 镜岩镜岩, ,朱圣庚朱圣庚, ,徐长法主编徐长法主编 高教出版

2、社高教出版社 2蛋白质技术手册蛋白质技术手册 汪家政，范汪家政，范 明主编明主编 科学出版社科学出版社 3生物化学与分子生物学实验常用数据手册生物化学与分子生物学实验常用数据手册 吴冠芸，潘华珍，吴吴冠芸，潘华珍，吴 恽主编恽主编 科学出版社科学出版社 4蛋白质纯化指南蛋白质纯化指南 （第二版）（第二版） R.R. R.R. 伯吉斯伯吉斯, M.P. , M.P. 多伊彻多伊彻 编著编著 陈薇陈薇 主译主译 科学出版社科学出版社 5蛋白质分析实验技术指南蛋白质分析实验技术指南李玉花李玉花 主编主编 科学出版科学出版 社社 第一章 绪论 n牛胰岛素 n人源葡萄糖转运蛋白GLUT1 牛胰岛素 n提

3、出-1958年与美、德科研小组同时独 立提出这一课题 n背景-1958年，没有不可征服的科学高 峰 n初期： 短暂的正常研究阶段 （已获得 拆、合天然胰岛素等几项重要的成果。 ） 牛胰岛素 n高潮：混乱的大兵团作战 （正常的科研 程序被严重干扰；对参与研究的人员造 成了很大的身体伤害 ） n苦撑：北大最少时只剩下两个科研人员 n攻关：各单位放弃内部竞争通力协作， 终于结出硕果 。 诺贝尔奖？ n1923年，班丁(FGBanting)和麦克劳德 (JJRMac1eod)因为发现胰岛素和使用胰岛素治疗 糖尿病而荣获了医学和生理学诺贝尔奖； n1955年，维格纳奥德因为合成多肽激素催产素而获得诺 贝

4、尔化学奖； n1958年，桑格因为分离和确定胰岛素的氨基酸组分的构 成而荣获诺贝尔化学奖； n1972年，安芬森(CBAnfinsen)等人因为发现氧化被 还原的核糖核酸酶肽链能恢复活力而获得诺贝尔化学奖； n1984年，梅里菲尔德(RBMerrifleld)因为发明固相 合成方法而获得诺贝尔化学奖。 葡萄糖转运蛋白 n细胞的葡萄糖摄取通道 n易化扩散 n与糖尿病的关系 n与肿瘤的关系 Mueckler, M. et al. Science 229, 941945 (1985) Amann, T. & Hellerbrand, C. Expert Opin. Ther. Targets 13,

5、 14111427 (2009) n葡萄糖是地球上各种 生物最重要、最基本 的能量来源，也是人 脑和神经系统最主要 的供能物质。 n须依靠转运蛋白这个 “运输机器”来完成 1 1，催化剂催化剂 酶（碳酸酐酶）酶（碳酸酐酶） 2 2，结构成分结构成分 胶原蛋白胶原蛋白 3 3，贮藏功能贮藏功能 麦醇溶蛋白（小麦种子）麦醇溶蛋白（小麦种子） 4 4，运输功能运输功能 血红蛋白（氧分子），血红蛋白（氧分子），跨跨 膜运输膜运输 5 5，运动功能，运动功能 肌肉收缩，细菌鞭毛肌肉收缩，细菌鞭毛 6 6，激素，激素 胰岛素，生长激素胰岛素，生长激素 7 7，防御（免疫），防御（免疫） 抗体（免疫球蛋白）

6、抗体（免疫球蛋白） 8 8，接受、传递信息，接受、传递信息 视觉，味觉视觉，味觉 9 9，调节生长发育，调节生长发育 蛋白质主要功能 功能紊乱导致的疾病 导致：婴儿癫痫发作、Fanconi-Bickel综合症、 糖尿病、肥胖 Thorens, B. & Mueckler, M. Glucose transporters in the 21st Century. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, E141E145 (2010) 功能紊乱导致的疾病 nGLUT1功能完全缺失将致死 nGLUT1在癌细胞的新陈代谢过程中也发 挥着重要功能。 Macheda

7、, M. L., Rogers, S. & Best, J. D. Physiol. 202, 654662 (2005) n饿死癌细胞？ 结构解析结构解析 n酵母表达系统酵母表达系统 昆虫表达系统昆虫表达系统 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统 n表达的蛋白具有正常的表达的蛋白具有正常的 活性、构象活性、构象 n技术难度较大、耗时、技术难度较大、耗时、 耗资耗资 n大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统 n实验技术简单，时间实验技术简单，时间 较短，费用低，系统较短，费用低，系统 比较完备比较完备 n不能有效地对重组蛋不能有效地对重组蛋 白质进行修饰加工，白质进行修饰加工， 易形成包涵体易形

8、成包涵体 原核细胞表达系统原核细胞表达系统 真核细胞表达系统真核细胞表达系统 表达系统 结构解析 Linfeng Sun ，et al. 2013. Nature. 2013年清华大学的颜宁教授课题组报道了人的葡萄糖转 运蛋白GLUT1-4在大肠杆菌中的同源蛋白XylE的晶体结 构，并且运用生化手段对其工作机理进行了研究。 人源葡萄糖转运蛋白GLUT1 n葡萄糖是地球上各种 生物最重要、最基本 的能量来源，也是人 脑和神经系统最主要 的供能物质。 n须依靠转运蛋白这个 “运输机器”来完成 GLUT1对健康的影响 nGLUT1功能完全缺失将致死 nGLUT1在癌细胞的新陈代谢过程中也发 挥着重要

9、功能。 GLUT1对健康的影响 nGLUT1功能完全缺失将致死 nGLUT1在癌细胞的新陈代谢过程中也发 挥着重要功能。 团队：这项具有里程碑意义的科研成果是 由一个清华大学的年轻团队完成的 ，第 一作者邓东博士为80后 ，三位共同第一 作者都是90后 。 n细胞培养 n提纯蛋白 n蛋白结晶 n不要把你纯粹的思想浪费在不纯的酶上！ -Efraim Racker n经典酶学方法：20世纪初无细胞条件下 蔗糖 乙醇 -Eduard Bchner n从现象追踪到功能（乙醇发酵、糖酵解 等） 为什么要纯化酶？ 目录 n主要仪器介绍和安全规范 n蛋白质样品制备 n蛋白质的表达与纯化 n蛋白质与其他物质的

10、相互作用 第一讲 主要仪器介绍和安全规范 离心机操作注意事项 n使用之前要仔细阅读说明书 n了解： 最大转速、所需转头、温度。提前预约。 n操作： 检查转头是否牢固固定 检查盖是否完全吻合盖好 提前预冷，预冷时要拧好盖 严格配平 操作过程若暂时不用要盖上机盖 升速和降速过程要多加注意 噪声大时要选择降速并联系老师 离心机操作注意事项 使用后： n离心机使用完毕后，若有液体溅出要联系老师取出转子， 清洁后倒置放在干燥、平稳的地方。 n转子清洁时只能用中性洗涤液，禁止用腐蚀性液体擦拭。 n使用致冷功能后在关闭电源时不要盖上离心机盖，应待离 心机腔体内冷凝结的霜完全融化后，用干净的软布擦干水 滴并充

11、分晒干后再盖上离心机盖，否则会导致机器生锈。 n仪器断电后再开机应间隔3分钟以上，防止损坏压缩机。 离心机操作注意事项 高压灭菌锅操作步骤 1、确认电源的正确连接，将灭菌锅右侧的 电源开关打开，然后按下“POWER ON/OFF”键开机。 2、确认锅内压力为0的情况下，轻轻向下按 灭菌器盖的把手，脚踏盖锁解除踏板，把盖 打开。向灭菌锅内注水(蒸馏水)直到看到水 漫过底盘中心孔的横杠（大约需要2.0升 水）。 3、放置待灭菌的物品，盖上盖子到磁封条 封好，将盖锁住。注意不要过满，不要有单 独的小型颗粒。 4、选择运行模式（一般均选择普通灭菌模 式，选其他模式需要请示安全员）。 高压灭菌锅操作步骤 5、启动灭菌程序： （1）确定放气瓶内的水位在“HIGH”和 “LOW”之间； （2）确定排水瓶内的水位足够低，不会碰 到排气管的顶端； （3）按“START/STOP”键启动灭菌程序。 7、灭菌完成后，温度降至90度以下（锅内 压力为0）的情况下才能打开盖子，拿出灭 好的物品。 8、按“PO