经典色谱法液相

1、1第10章 经典液相色谱法 液相色谱法液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称。以液体为流动相的色谱法称。经典液相色谱经典液相色谱：固定相颗粒较固定相颗粒较大大且且不均匀不均匀 常压常压下输送流动相下输送流动相 柱效较柱效较低低 分析周期分析周期长长现代液相色谱：现代液相色谱：固定相颗粒固定相颗粒且且高压高压下输送流动相下输送流动相 柱效较柱效较高高 分析周期分析周期短短2第第1 1节节 液液- -固吸附柱色谱固吸附柱色谱（一）分离原理（一）分离原理（二）常用吸附剂（二）常用吸附剂（三）色谱条件的选择（三）色谱条件的选择3 各组分与流动相分子争夺吸附剂各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心表面活

2、性中心， 利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸附吸附 能力差异能力差异而实现分离而实现分离固定相为固体吸附剂，属吸附色谱固定相为固体吸附剂，属吸附色谱（一）分离原理（一）分离原理4（二）、吸附剂（二）、吸附剂对吸附剂的要求：对吸附剂的要求：（1 1）具有较大的表面积和一定的吸附能力）具有较大的表面积和一定的吸附能力（2 2）颗粒要有一定的细度）颗粒要有一定的细度(d=75-150m(d=75-150m，即，即100-200100-200目目) )，且粒度均匀，且粒度均匀（3 3）与洗脱剂及样品不起反应）与洗脱剂及样品不起反应常用：硅胶、氧化铝、聚酰

3、胺、活性炭、大孔树脂常用：硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭、大孔树脂5吸附机制：吸附机制： 表面的硅醇基，与物质形成氢键表面的硅醇基，与物质形成氢键适用范围：适用范围：微酸性（微酸性（pH=45），）， 适于酸性和中性物质适于酸性和中性物质失活：失活：水与硅醇基结合使其失去活性水与硅醇基结合使其失去活性活化：活化：105-110105-110加热加热30min30min粒度：粒度：100-200100-200目目1. 硅胶（硅胶（SiO2H2O）中等极性吸附剂中等极性吸附剂6 碱性氧化铝碱性氧化铝 pH 9pH 910 10 适于分析碱性、中性物质适于分析碱性、中性物质 如：生物碱如：生物碱 中性

4、氧化铝中性氧化铝 pH 7.5 pH 7.5 适于分析酸性碱性和中性物质适于分析酸性碱性和中性物质 如：生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸碱中不稳定的如：生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸碱中不稳定的苷类、酯、内酯等化合物苷类、酯、内酯等化合物 酸性氧化铝酸性氧化铝 pH 4pH 45 5 适于分析酸性、中性物质适于分析酸性、中性物质 如：酸性色素、氨基酸、对酸稳定的中性物质如：酸性色素、氨基酸、对酸稳定的中性物质2. 氧化铝氧化铝7硅胶、氧化铝的含水量与活性关系硅胶、氧化铝的含水量与活性关系 硅胶含水量硅胶含水量%活度级活度级氧化铝含水量氧化铝含水量%005315625103815活度测定法：活

5、度测定法：BrockmamnBrockmamn法法83 3、聚酰胺、聚酰胺CH 2CH CH CH CH CONH2222n商品名：锦纶、尼龙商品名：锦纶、尼龙-6不溶于水和有机溶剂，易溶于浓无机酸不溶于水和有机溶剂，易溶于浓无机酸分离机制：主要是分离机制：主要是氢键吸附氢键吸附适用对象：适用对象：黄酮类、鞣质、醌黄酮类、鞣质、醌粒度：粒度：2020100100目目氢键能力氢键能力强强组分越后出柱组分越后出柱 9（三）色谱条件的选择：（三）色谱条件的选择：1. 1. 被测组分性质（极性大小）：被测组分性质（极性大小）： 烷烃烯烃醚烷烃烯烃醚 硝基化合物硝基化合物 二甲胺二甲胺酯酮酯酮醛醛 胺胺

6、酰胺醇酚羧酸酰胺醇酚羧酸依据被测组分、吸附剂和流动相的性质依据被测组分、吸附剂和流动相的性质2. 2. 吸附剂的选择：吸附剂的选择： 吸附剂的活性吸附剂的活性大，对被测组分的吸附能力大，对被测组分的吸附能力强强 强极性物质强极性物质选择弱吸附剂选择弱吸附剂 弱极性物质弱极性物质选择强吸附剂选择强吸附剂酸性成分：硅胶酸性成分：硅胶 碱性成分：氧化铝碱性成分：氧化铝 黄酮类：聚酰胺黄酮类：聚酰胺用量：用量： 化学分离：化学分离：30倍倍 除杂：除杂：10倍倍11 “相似相溶相似相溶”原则原则 ：分离分离极性大极性大的物质应选用的物质应选用极极性大的溶剂作流动相性大的溶剂作流动相，分离，分离极性小极

7、性小的物质应选用的物质应选用极性小的溶剂作流动相，极性小的溶剂作流动相，3、流动相的选择、流动相的选择流动相极性：流动相极性：烷烃烷烃 苯苯 乙醚乙醚 氯仿氯仿 酯酯 酮酮 醇醇 1.51.5 使待测组分的使待测组分的R Rf f在在0.30.30.50.5 展开后各斑点圆而集中，不拖尾展开后各斑点圆而集中，不拖尾 具有适中的沸点和小的粘度具有适中的沸点和小的粘度 临用前配制临用前配制2 2、展开剂、展开剂36展开剂的组成：单一溶剂、多元溶剂展开剂的组成：单一溶剂、多元溶剂 单一溶剂：重现性好，分离能力差单一溶剂：重现性好，分离能力差 多元展开剂：可改善分离效果，重现性差多元展开剂：可改善分离

8、效果，重现性差展开系统的优化展开系统的优化优化原则：优化原则：先调整展开剂极性使待测组分先调整展开剂极性使待测组分R Rf f值适中，保持这个极性不变，改变展开剂的值适中，保持这个极性不变，改变展开剂的选择性，直至所有组分有合适的分离度选择性，直至所有组分有合适的分离度Stahl图解法图解法展开剂展开剂极性极性非极性非极性V活性活性I吸附剂吸附剂待测物待测物非极性非极性极性极性展开系统的优化展开系统的优化Rf值的决定因素：值的决定因素：组分极性组分极性展开剂的极性展开剂的极性 吸附剂的活性吸附剂的活性38 加入少量的酸碱加入少量的酸碱常用酸：常用酸：甲酸、冰醋酸甲酸、冰醋酸常用碱：常用碱：浓氨

9、水浓氨水、乙二胺、乙二胺展开系统的优化展开系统的优化 展开剂用量：展开剂用量：展开剂浸没薄板下端约展开剂浸没薄板下端约0.5cm0.5cm39常用展开系统常用展开系统人参皂苷、黄芪甲苷：人参皂苷、黄芪甲苷：氯仿氯仿-甲醇甲醇-水（水（65：35：10，下层），下层）正丁醇正丁醇-醋酸乙酯醋酸乙酯-水（水（4：1：5，上层），上层）黄酮苷：黄酮苷：醋酸乙酯醋酸乙酯-丁酮丁酮-甲酸甲酸-水（水（10：1：1：1）糖：糖：正丁醇正丁醇-冰醋酸冰醋酸-水（水（4 4：1 1：5 5，上层），上层）展开系统的优化展开系统的优化中等极性：中等极性：甲苯甲苯-醋酸乙酯醋酸乙酯-甲酸甲酸（1010：3 3：0

10、.5)0.5) 40苯苯醋酸乙酯醋酸乙酯甲醇甲醇异丙醇异丙醇浓氨水浓氨水（6：3：1.5：1.5：0.5）展开系统的优化展开系统的优化413 3、展开过程的控制、展开过程的控制（1）展开方式：多次、分步展开）展开方式：多次、分步展开ABAB一次展开一次展开多次展开多次展开原因：低极性低沸点物质在薄层板边缘易挥发原因：低极性低沸点物质在薄层板边缘易挥发产生边缘效应产生边缘效应克服办法：克服办法： a “预饱和预饱和” b 层析缸内壁贴浸湿的滤纸条层析缸内壁贴浸湿的滤纸条 c 点样时不要太靠边缘点样时不要太靠边缘展开过程的控制展开过程的控制（2 2）溶剂蒸气的饱和程度）溶剂蒸气的饱和程度43（3

11、3）湿度）湿度相对湿度硫酸（ml）+水（ml）32%6810042%5710058%39.510065%3410072%27.510088%1.8100（4 4）温度）温度展开过程的控制展开过程的控制441、定位方法：日光检视、定位方法：日光检视 紫外光紫外光365nm下检视下检视 紫外光紫外光254nm下检视下检视检检 测测荧光淬荧光淬灭斑点灭斑点45a 喷雾显色喷雾显色注意：喷雾显色前展开剂须注意：喷雾显色前展开剂须挥干挥干 喷雾宜喷雾宜细而均匀细而均匀 b 浸渍显色浸渍显色注意：注意： 浸渍液溶剂易挥发，否则斑点扩散浸渍液溶剂易挥发，否则斑点扩散 浸渍时间为几秒浸渍时间为几秒检检 测测2

12、 2、显色剂：与待测物质反应生成有色化合物、显色剂：与待测物质反应生成有色化合物46 1） 加热加热 加热时应把握好时间和温度，特加热时应把握好时间和温度，特别在定量时应注意别在定量时应注意(常常510min) 2）防止显色后褪色）防止显色后褪色加热显色后的板加热显色后的板盖上一洁净的玻板并封盖上一洁净的玻板并封边，放边，放置于干燥器中置于干燥器中注意：注意：检检 测测47四、高效薄层色谱法（四、高效薄层色谱法（HPTLCHPTLC）高效薄层板：粒度高效薄层板：粒度510m m 普通板：普通板：1040m m特点：点样量小，展距短，特点：点样量小，展距短， 斑点集中，分离度好，斑点集中，分离度

13、好， 灵敏度高灵敏度高48五、聚酰胺薄层色谱法五、聚酰胺薄层色谱法聚酰胺色谱是分离黄酮类是最有效的方法聚酰胺色谱是分离黄酮类是最有效的方法常用溶剂系统常用溶剂系统苷元：氯仿苷元：氯仿- -甲醇（甲醇（9696：6 6） 氯仿氯仿- -甲醇甲醇- -甲酸（甲酸（3030：2020：1 1） 苷：苷： 甲醇甲醇- -水（水（4 4：1 1） 30%30%60%60%醋酸醋酸49六、纸色谱法六、纸色谱法1、载体：纸、载体：纸 固定相：纤维素结合的固定相：纤维素结合的水水，属属正相正相分配色谱分配色谱 展开剂：有机溶剂（正丁醇）展开剂：有机溶剂（正丁醇）2 2、适用：极性化合物（多糖）、适用：极性化合

14、物（多糖）CHOC-OHHCHOH-CH-OHCH-OHCH -OH2CHOCHOH-CH-OHCH-OHOH-CHCH3CHOCH-OHCH-OHCH-OHCH 2CH3葡萄糖葡萄糖鼠李糖鼠李糖毛地黄毒糖毛地黄毒糖极性极性最强最强其次其次最弱最弱Rf值值最小最小其次其次最大最大3、Rf值与物质的化学结构的关系：值与物质的化学结构的关系：51样品预处理样品预处理七、薄层色谱法的应七、薄层色谱法的应用用52依据：固定色谱条件下，相同物质的依据：固定色谱条件下，相同物质的Rf值相同值相同1供试品供试品 2对照药材对照药材 3对照品对照品4 阴性对照阴性对照1 2 3 4（一）定性鉴别（一）定性鉴别

15、531、 限量检查限量检查如：附子中乌头碱的限量检查如：附子中乌头碱的限量检查1. 乌头碱对照品乌头碱对照品2，3，4. 样品样品1 2 3 4（二）定量分析（二）定量分析2 2、洗脱测定法、洗脱测定法准确吸取准确吸取直线状点样，直线状点样，置于置于层析缸层析缸中，展至中，展至14cm14cm，取出晾干，于紫外灯下，取出晾干，于紫外灯下，用针将用针将R Rf f值约为值约为0.40.4的盐酸吗啉双胍谱带划的盐酸吗啉双胍谱带划出，出，用刮刀将谱带全部刮入用刮刀将谱带全部刮入100 ml100 ml容量瓶容量瓶中，中，准确加入准确加入50ml50ml蒸馏水，振摇蒸馏水，振摇静置静置离心。准确吸取上清液离心。准确