基质金属蛋白酶MMP2MMP9及其抑制剂TIMP1与乳腺癌转移的相关性研究

1、基质金属蛋白酶mmp2，mmp9及其抑制剂timp1与乳腺癌转移的相关性研究 吉林大学硕士学位论文此论文是在我的导师刘国津 教授悉心指导下完成的。感谢他在 我三年的学习,工作和生活等诸多 方面给予的谆谆教诲、殷切关怀和 辛勤的培养。在此,谨向我的导师 表示深深的敬意和由衷的感谢。?1?吉林大学硕士学位论文 目 录提要?1 前言?2 材料和方法?6 结果?9 讨论?12 结论?16 参考文献?17 照片?20 致谢?23 中文摘要?1 英文摘要?4 ?2?吉林大学硕士学位论文提 要 临床观察表明,恶性肿瘤患者大多死于转移。作为癌细胞最重要的生物学特性,浸润和转移是许多学者关注的热点问题。目前研究

2、表明,基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteineses,mmps)可有效的降解细胞外基质(extracell matrix,ecm)成分,破坏基底膜,从而排除了浸润和转移的首遇障碍,其家族成员中的 mmp2,mmp9及其组织抑制剂 timp1(tissue inhibitor of metalloproteinase,timp1)表达异常与人类恶性肿瘤的浸润和转1移密切相关 。目前在国内尚未见有关基质金属蛋白酶和乳腺癌的关系的报告。因此,我们采用临床观察和免疫组化法对 31例乳腺癌组织进行标记及分析,探讨基质金属蛋白酶(mmps)在乳腺癌中表达的意义,显示 mmp2和 m

3、mp9及其组织抑制剂 timp1的异常表达与乳腺癌的浸润及转移密切相关。mmp2和 mmp9阳性表达率,淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组。表明 mmp2和mmp9在乳腺癌细胞突破细胞外基质(ecm),基底膜向外扩散及转移过程中起着重要作用,两者参与了乳腺癌的转移过程。timp1则可抑制它们对 ecm的降解而抑制肿瘤细胞的浸润和转移。通过对基质金属蛋白酶(mmps)的研究,揭示乳腺癌转移的机制。鉴于 mmps家族最早参与肿瘤的浸润和转移,抑制 mmps的药物可作为防止癌症转移的有效药物,这将为肿瘤的治疗开辟一条新的途径。?3?吉林大学硕士学位论文 前 言 恶性肿瘤的典型特征是对外周组织极具侵袭

4、性,在远隔器官2-4有形成转移肿瘤的能力 。肿瘤的浸润和转移是恶性肿瘤的主要生物学特征,也是恶性肿瘤患者的主要死因。近年来,人们在肿瘤浸润机制及抗浸润转移治疗领域进行了广泛研究,并已取得了相当的进展。通过研究发现细胞外基质(ecm)在肿瘤的浸润与转移过程中起了关键性的作用,恶性肿瘤细胞必须通过细胞外基质(ecm),及基底膜这一首遇障碍才能经细胞外基质的缺损处向外扩散。在上述过程中基质金属蛋白酶(mmps)发挥着重要作5,6用 。基质金属蛋白酶(mmps)通过对 ecm的降解进而促进癌细胞对周围组织的浸润,最后达到癌细胞的远处转移。 mmps在肿瘤转移中的作用可概括如下:(1)破坏局部组织结构,

5、促进肿瘤生长。(2)破坏基底膜屏障,促发肿瘤转移。(3)通过对细胞外基质的改建,增进肿瘤新生血管的形成。自 1962年 gross和 lapiere首次报道胶原酶以来,目前已发现了大约 14种左右基质金属蛋白酶(mmps)。它们几乎能降解细胞外基质的所有成分,因而成为近年来肿瘤侵袭和转移研究的热点。基质金属蛋白酶是一组锌离子依赖性蛋白酶,同一种 mmp可降解多种细胞外基质成分,而某一种细胞外基质成分又可被多种 mmp降解,但不同酶的降解效率可以有所不同。mmps几乎能降解细胞外基质的所有成分,它们既参与某些生理过程(胚胎发育、产后子宫复旧、排卵和创伤愈合等);又参与某些病理过7程(类风湿性关节

6、炎和肿瘤浸润等 )。经典的 mmps主要分为4?吉林大学硕士学位论文 三大类:1)间质胶原酶类;2) 明胶酶类;3)间质溶解素。分子量为 72kd的 mmp2和分子量为 92kd的 mmp9为明胶酶或iv型胶原酶,二者特性相似,不但可以酶解细胞间基质成分,8还能酶解基底膜主要成分型胶原 。已有大量研究显示 iv型胶原酶与多种肿瘤的侵袭转移有关。主要降解明胶和、型胶原;但 mmp2为非糖基化,主要由成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞合成,而 mmp9多被糖基化,主要由中性白细胞、巨噬细胞、角质细胞、肿瘤转化细胞产生。目前发现 mmp2和 mmp9在恶性肿瘤中如:结肠直肠癌、胃癌、鼻咽癌等的癌细胞和细

7、胞外基质中都有较高的表达,与肿瘤的浸润和转移关系密切。在众多学者通过体外和体内的实验研究,对各种恶性肿瘤中9mmp2,mmp9的过度表达进行了深入的探讨。李楠等人 利用免疫组化和原位杂交的方法对 41例人胃癌和 17例癌旁组织中的mm9及 timp1进行了检测,结果发现 mmp9与 timp1蛋白在癌组织内的阳性率均高于癌旁组织,且 mmp9/timp1的比值与胃癌的侵袭、转移呈正相关, mmps阳性肿瘤的淋巴结转移率10(64%)明显高于 mmps阴性的肿瘤(33%)。jeziorska等人对结肠癌的研究发现除了中性粒细胞、巨噬细胞外还有一些恶性11 12上皮细胞也可以发现 mmp9的免疫反

8、应性 。zeng zs等人 研究了 71例原发性结直肠癌病例,发现肿瘤组织 mmp9浓度较正常粘膜明显高(p0.01),mmp9表达与性别、年龄、肿瘤位置、大小、分化或肠壁浸润深度无明显相关性,有淋巴结或远隔脏器转移的病例较无转移的病例 mmp9表达增高,而且高表达的病例5?吉林大学硕士学位论文 术后无病存活期明显短于低表达者,可见 mmp9的检测对于判定肿瘤的预后也有意义。在此之前,zeng zs等人还研究了伴有肝转移的结直肠癌,发现肝转移灶中 mmp9mrna较其原发病灶的表达更高,这充分说明了 mmp9和结直肠癌的转移关系密切。在前列腺癌、结肠癌、肺癌均有 mmp2a mrna表达的增加

9、。在mmp9与肺癌关系的研究中人们发现:mmp9在 12例鳞癌患者的切片上均有表达。mmp9的 mrna定位于肿瘤细胞和肿瘤周围宿主基质细胞,而非正常肺成纤维细胞。mmp9在肺腺癌未见表达。研究发现在一些正常肺组织,包括支气管上皮、支气管上皮的基底细胞增生灶、肺泡巨噬细胞和支气管粘液腺均可有 mmp9的低水平表达。另外尚有一些研究证明 mmps中基质分解素 iii与原发性肺癌、头颈部鳞癌、基底细胞癌的浸润及恶性程度有关。13结肠、直肠癌的免疫组化研究表明 :基质细胞及邻近癌细胞巢的胶原纤维间质胶原酶染色增强;而正常组织或良性上皮组织未见此酶染色。结肠、直肠癌患者间质胶原酶过度表达预后不良。40

10、%的原发性肺恶性肿瘤组织间质胶原酶转录增强,而邻近的正常肺组织则不然。头、颈部鳞状细胞癌的原位杂交研究表明:邻近恶性肿瘤细胞团块的基质成纤维细胞间质胶原酶转录增强。所有基质金属蛋白酶都受到天然抑制剂?金属蛋白酶组织14抑制剂(timp)的抑制 。其在抑制肿瘤 mmps活性的同时,也抑制了肿瘤细胞的浸润和转移能力。基质金属蛋白酶组织抑制因子(timp1)可通过下调金属蛋白酶的降解活性而抑制肿瘤细胞的浸润和转移。两者的不平衡导致许多疾病的发生,如肿瘤的侵6?吉林大学硕士学位论文 入及转移。合成金属蛋白酶组织抑制剂能起到控制肿瘤转移的发生及进一步扩散。迄今为止,国内尚未见有关基质金属蛋白酶及其组织抑

11、制剂与乳腺癌的相关性的报道。本实验采用免疫组化法,旨在揭示基质金属蛋白酶家族中的主要成员?明胶酶,包括明胶酶 a(mmp2),明胶酶 b(mmp9)及其组织抑制剂(timp1)对乳腺癌转移方面的作用,为判定肿瘤性质及预后提供可靠依据,也为恶性肿瘤的治疗提供了一条新的思路。?7?吉林大学硕士学位论文 材 料 与 方 法 (一)材料来源所有临床材料及病理组织标本均取自白求恩医科大学第一医院肿瘤外科和基本外科。随机选出 31例乳腺癌患者,均经病理检查确诊为乳腺癌。其中导管内癌 2例,浸润性小叶癌 1例,其余均为浸润性导管癌。病人平均年龄为 47.1岁,最大 73岁,最小 26岁,均未经化学及放射等抗

12、癌治疗。10例乳腺良性病变作为良性病例对照。 (二)一般组织学处理所取组织均用 10%福尔马林固定液固定标本,标本固定后,经乙醇梯度脱水,二甲苯透明,浸蜡包埋。做连续组织切片,厚度为 4m,备 he染色及免疫组织化学染色。 (三)免疫组织化学染色1、试剂 所使用的一抗 mmp2,mmp9和 timp-1均为单克隆鼠抗人抗体,其与 sp染色试剂盒均购自福州迈新公司。2、染色步骤 免疫组织化学染色采用 sp 法。步骤如下:(1)组织切片梯度脱蜡至水。(2)0.01m枸橼酸盐缓冲液微波处理至 98温静置 30分,pbs洗 53(timp-2适用)。(3)应用 3%的 h o蒸馏水阻断内源性过氧化物

13、15分钟,pbs液冲洗2 25分钟三次(53)。(4)滴加正常羊血清封闭 20分钟。(5)去除多余血清。(6)滴加第一抗体(37)孵育 60分钟。(7)8?吉林大学硕士学位论文 pbs液冲洗 53。(8)滴加第二抗体(37)孵育 25分钟。(9)pbs液冲洗 53。(10)滴加第三抗体(37)孵育 25分钟。(11)pbs液冲洗 53。(12)dab发色 15分钟。(13)marrys苏木精复染核。(14)脱水、透明、封片。3、对照:免疫组织化学染色过程中,以 pbs代替一抗作阴性对照;以已知的 mmp2,mmp9和 timp-1阳性的胃癌组织切片做阳性对照;以 pbs液代替第一抗体作为阴性对

14、照。4、结果判定: 在不知道任何临床和病理资料的情况下,对免疫组织化学染色进行观察判定,以在肿瘤细胞胞浆,胞膜及癌巢周围基质出现棕黄色颗粒,其着色强度高于背景非特异性染色者判定为阳性。 (四)形态学定量及统计学处理 15,161、组织学分级标准(bloom and riohardson 1957年) a.管腔形成:1分?切片显示明显的腺腔形成2分?部分腺腔形成3分?小的或不分化的细胞呈片状或海岸线生长b.染色质过多和核分裂像:1分?在高倍视野中,偶尔找到 1个浓染核或核分裂像2分?大多数高倍视野中,有 2-3个这类细胞3分-该类细胞更多?9?吉林大学硕士学位论文c.核大小、形状和染色质不规则:

15、1分-轻度差别2分-中等度不一致3分-明显的多形性把 a,b,c三项标准得分相加,计算总分,确定分级。35分为 i级,低度恶性;67分为 ii级,中度恶性;89分为 iii级,高度恶性。2、形态定量方法:mmp2和 mmp9免疫组织化学染色的计量方法采用 eastham的方法;即无着色为 0;切片中癌组织阳性染色弱,着色面积(50%判定为 1+;染色弱,面积)50%判定为 2+;染色强,面积(50%判定为 3+;染色强,面积)50%判定为 4+。此计量判断由两名观察者独立完成。并依据文献,将染色强度(0-2+)化为低表达,染色强度(3+-4+)化为高表达。timp1的计量则根据着色范围,着色范

16、围大于 50%为 2+,小于 50%为 1+,无表达为(-)。 (五)统计学处理 2 将全部临床资料输入计算机,采用 检验和 fisher检验,所有数据均应用 spass软件包处理,以 p0.05或 p0.01为具有统计学意义,p0.05,而与患者的淋巴结转移情况有明显的关系,即在淋巴结转移阳性组中,mmp2,mmp9的表达例数明显高于阴性组;而 timp1的表达例数明显低于阴性组p0.001。3. 乳腺癌 mmp2,mmp9及 timp1的表达与淋巴结转移间的多因素分析发现:mmp9(+)/timp1(-)组 5例全部为淋巴结转移者。而在 mmp9(-)/timp1(+)组中 18例均无淋巴

17、结转移。两者比较有明显的统计学意义 p0.001。在 mmp2高/timp1(-)组中,5例均为淋巴结转移阳性,而 mmp2低/timp1(+)组 16例中 14例为淋巴结转移阴性,只有 2例阳性。两者比较亦有明显的统计学意义 p0.001。?25?吉林大学硕士学位论文总之,本研究阐明了 mmp2,mmp9及 timp1在乳腺癌中的表达特点及其与临床指标间的关系;为进一步研究肿瘤转移的判定标准和研制抗肿瘤转移药物提供了新的实验依据。关键词:基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶组织抑制剂 乳腺癌 肿瘤转移?26?吉林大学硕士学位论文 abstract one of important characte

18、ristic for malignant tumor is invasiving crosponding normal tissue and becoming metastatic focus. with the development from in situ carcinoma to infiltrative and metastatic carcinoma, tumor cell must has a capability to degradate extracellular matrix ecm and basement membrance. this needs a series o

19、f protein hydrolase to take part in. among them, matrix metalloproteineses mmps is most important. with the process of tumor metastasis, tumor cell passing through basement membrance is the key point of forming metastasis. basement membrance is formed by collagen , laminin and other molecules. among

20、 them, collagen is the main part of basement membrance. study of these years found that mmps may promote tumor growth through destroying partly tissue structure, destroying basement membrance as abarricade and promote tumor angingenesis through reconstructing extra cellular matrix in the process of

21、tumor metastasis. therefore, it sounds like very important to study mmps expression and regulation mechanism in carcinoma. mmp2 and mmp9 of mmps are enzyme of collagen , which can degradate collagen of basement membrance efficiently. in normal condition, mmp9 takes part in metabolize of extracellula

22、r matrix and embodies significant role in many tissues reconstruction such as embryo dysplasia, bone tissue reconstruction, discriminating?27?吉林大学硕士学位论文 outsiders and damage repair. when its active is abnormal, it takes important role in tumor invasion and metastasis the purpose of this study is to

23、detect the meaning of mmps and tissue inhibitor of metalloproteinase timp expression and its relationship with tumors invasion and metastasis in breast carcinomaclinical observation and immunohistochemistry method were used to analyze mmp2, mmp9 and timp1 in 31 cases of breast carcinomameanwhile, sole-and multi-factor analysis were carried out with related referencethe results were:1. mmp2 expression is positive weakly 1+-2+ in 10 cases of breast benign tumor. but, mmp9 expression is negative. ti