谈论病原体对红细胞影响

1、谈论病原体对红细胞影响 作者：朱家明 杨玲玲 任芙蓉 王卓妍 单位：北京市红十字血液中心 ph测定测定前按照仪器说明书校准，k+浓度测定每次测定前做质控测定，当k+浓度20mmol/l时，稀释后再测定，溶血率检测游离hb浓度测定取rbc-to-map液2ml加入5ml试管内，取样100l加入试剂管内，37孵育20min，测定吸光度，按标准曲线计算浓度。1.6.2红细胞内hb浓度测定将rbc-to-map液以齐文液稀释50倍，取其5ml加入试管内，取样100l，10min后测定od值，由标准曲线计算浓度。溶血率计算溶血率(%)=游离血红蛋白总量/总血红蛋白量100%。atp测定样品准备将rbc-

2、to-map样品用0.9%生理盐水洗涤5次，再用pbs稀释10000倍，取2ml加入微量离心管中，在100水中加热10min，在4下放置20min，400g离心5min，取上清部分测定atp浓度。1.7.2测量方法取测量样品(100l/孔)加入96孔板内，加入试剂(100l/孔)，轻轻振荡后放置10min，测量萤光强度;用标准品建立标准曲线，计算样品atp浓度;再依红细胞内hb浓度计算atp/ghb。，3-dpg浓度测定样品准备取洗涤后rbc-to-map样品2ml加入5ml试管内，冰水浴5min，加入冰醋酸5ml，1750g离心10min，取上清部分2ml加入5ml试管内，再加5mol/l碳

3、酸钠2ml，1750g离心10min，取上清部分，24h内测定。测量方法以动力学方法测得30min内320nm吸光度的下降值，减去空白对照下降值为样品净下降值;2，3-dpg浓度(mol/l)=样品340nm吸光度下降值11.7，再依红细胞内hb浓度计算2，3-dpgmol/ghb=2，3dpg浓度(mol/l)/hb浓度(g/l)。1.9统计学分析应用spss17.0统计软件，数据以“均数标准差(珋xs)”2组间比较采用配对t检验，p0.05或001为差异具有统计学意义。 ph测定红细胞实验储存期内的ph值:实验组从0d的7.030.07降到6.600.09，对照组相应从6.950.09降到

4、6.570.07(图略)溶血率检测红细胞实验储存期内的溶血率(%):实验组从0d的0.050.03上升到35d的0.270.06，对照组相应从0.040.01上升到0.110.04;可见随着储存时间的延长，2组间溶血率差异愈来愈大，且各时间点实验组数据的离散程度明显大于对照组(35d时2组的溶血率比较，t=9.12，p0.01)(图略)。k+浓度测定红细胞实验储存期内的k+浓度(mmol/l):实验组从0d的6.821.72l上升到35d的40.412.94，对照组相应从5.71.4上升到28.333.34;实验组储存前7d上升极其明显，7d时的k+浓度为35d时的83%(35d时2组的k+浓

5、度比较，t=13.22，p0.01)2.4atp浓度检测红细胞实验储存期内的atp浓度(mol/ghb):保存期末(35d)时实验组为2.400.49，是0d时(4.230.58)的56.7%，下降43.3%;对照组为2.990.44，是0d时(5.180.64)的57.7%，下降42.3%。各时间点2组的atp浓度下降速度相似(p0.05)，但atp绝对浓度实验组均低于对照组(35d时2组的atp浓度比较，t=3.45，p0.05)(图略)。2.52，3-dpg浓度测定红细胞实验储存期内的2，3-dpg浓度(mol/ghb):实验组从0d的9.431.14下降到28d的0.640.53，对照

6、组相应从10.671.17下降到0.220.15;35d时2组均未检出2，3-dpg(0、14d时2组2，3-dpg浓度比较，值分别为3.43、2.57，p0.05) 在将红细胞制品中的病毒杀灭的同时，如何最大程度地保存红细胞结构完整和功能的齐全，是红细胞制品病毒灭活的主要难点之一;也是光化学灭活病毒方法从光敏剂的选择到灭活步骤的设计，贯穿全过程的主题。to作为新筛选的病毒灭活剂，所以受到关注，就是因其独特的结构赋予了它对红细胞较少损耗的特性。to原本作为dna探针已应用多年，其结构可分为噻唑环和喹啉2部分8，两者由亚甲基桥键连接。由于亚甲基桥键的可旋转性，赋予to分子以更大的柔软性;此外，t

7、o较其他染色剂结合红细胞的水平非常低，这可能是to对红细胞损耗较小的原因之一。我们曾测得to对红细胞的结合率为24.8%，而二甲基亚甲兰(dmmb)与红细胞的结合率则高达71.4%(数据未发表)。to在468nm光的激发下，产生具极强氧化性的单态氧和自由基氧，两者可以攻击核酸、红细胞膜脂质、膜蛋白质和血红蛋白等，这是to杀灭病毒的机制，也是其对红细胞造成损伤的原因。单态氧对红细胞膜脂质氧化攻击，特别是使不饱和脂肪酸更易氧化，氧化使不饱和脂肪酸数量逐渐减少，膜熔点增高，流动性下降，通透性增加;膜蛋白的氧化使膜蛋白交联、聚集，并形成高聚物;na+-k+-atp酶、ca2+-atp酶的氧化损失直接造

8、成k+的外流和ca2+的内流，ca2+的内流直接引起骨架蛋白的断裂、交联和聚集;膜带3蛋白的氧化使红细胞的阴离子转移功能下降;hb的氧化形成高铁血红蛋白并引起聚集，在细胞内沉积，不但影响携氧功能，而且降低了红细胞的变形性，易于溶血9，10。本组实验数据显示:实验组(rbc-to-map制品)和对照组(悬浮红细胞)在035d的ph差异不大(p0.05)(图1)。之所以实验组的各组ph值均较对照组略高，是因为在病毒灭活过程中，将原保存液移弃，更换成含有to的新to-map保存液。红细胞只是糖酵解，ph值的下降反映了红细胞代谢糖代谢情况，故这一结果提示to光化学法没有导致糖酵解大的变化。溶血率和k+

9、外漏反映光化学法对红细胞的膜损伤，尽管实验组的溶血率，与对照组比较有所增加，储存期末(35d)时实验组溶血率比对照组高1倍多(p0.01)(图2)，但仍符合红细胞保存期末溶血率0.8%的国标要求11。游离hb的增加，既可能是红细胞破裂增多，也可能是红细胞囊泡化严重。膜损伤的另一结果是造成膜通透性的增加，k+外漏增加，再加上na+-k+-atp酶功能下降，不能及时将外漏的k+泵回红细胞内，造成红细胞外液k+含量明显增加。本研究证实，rbc-to-map制品k+外漏主要发生在储存的第1周(图3)5。但我们在红细胞储存期的各观察时间点测得的atp含量，实验组均较对照组稍低(图4)，可能是由于采用荧光

10、法测定atp，不排除实验组to的微量残留对检测的影响。总之，实验储存过程中2组红细胞间atp下降趋势相似，说明to光化学法病毒灭活处理对atp影响不大5。atp含量是保持红细胞功能的必要条件之一，对于维持膜脂质的不对称性、na+-k+-atp酶和ca2+-atp酶的活性都是必需的，atp含量下降会造成红细胞形态异常和红细胞活性的下降。2，3-dpg是糖代谢旁路的产物，它能降低hb与氧的亲和力，有利于将更多的氧输送到组织处，因此2，3-dpg含量代表红细胞的携氧能力。我们的研究显示:在储存期的各观察时间点，2组红细胞的2，3-dpg浓度差异不大(图5)，说明to光化学法对红细胞的2，3-dpg含量变化的影响有限5。我们同步进行的一系列实验的结果显示:to光化学法可有效灭活多种病毒和细菌7，对红细胞的损伤较小。与病毒灭活剂dmmd相比，本组红细胞损伤指标中，溶血率明显低于dmmd法，atp浓度下降速度较dmmd法慢，2，3-dpg与dmmd法差异不大12。通过上述实验研究，我们证实to光化学灭活病