分子诊断项目课件

1、分子诊断项目课件1 分子诊断室项目介绍 分子诊断项目课件2 内 容 1.HBV-DNA荧光定量荧光定量PCR 2.流式基本应用流式基本应用 3.染色体核型分析染色体核型分析 分子诊断项目课件3 HBV DNA荧光定量PCR 分子诊断项目课件4 PCR技术简介 1985年美国年美国PE-cetus公司的人类遗传研究室公司的人类遗传研究室 mullis等人发明了具有划时代意义的等人发明了具有划时代意义的PCR技术，技术， 从而使人们梦寐以求的体外扩增核酸片段的愿望从而使人们梦寐以求的体外扩增核酸片段的愿望 成为现实。成为现实。 1988年年PE-cetus公司推出了第一台公司推出了第一台PCR热循

2、环仪，热循环仪， 从而使从而使PCR技术的自动化成为现实。技术的自动化成为现实。 Mullis出因其卓越的贡献与寡核苷酸基因定点诱变出因其卓越的贡献与寡核苷酸基因定点诱变 的发明者的发明者Michael分享了分享了1993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。 随着随着PCR技术的日臻成熟技术的日臻成熟1995年出现年出现荧光基因探针荧光基因探针 杂交定量杂交定量PCR方法方法 分子诊断项目课件5 PCR基本原理 z类似DNA的体内复制，以单链DNA为模板， 利用DNA聚合酶依赖于模板的特性，在附 加的一对寡核苷酸引物之间催化合成互补 链的过程。 分子诊断项目课件6 DNA 合成的必备要素合成的必备

3、要素 DNA Polymerase dNTPs single-stranded template primer 分子诊断项目课件7 定量定量PCRPCR概念概念 z以外参或内参为标准，通过对以外参或内参为标准，通过对 PCRPCR终产物的分析或终产物的分析或PCRPCR过程的过程的 监测，对监测，对PCRPCR起始模板量的定量起始模板量的定量 分子诊断项目课件8 常规常规PCRPCR与定量与定量PCRPCR的比较的比较 常规 PCR定量 PCR 反应方式2步法 3步法 2步法 3步法 反应液成分dNTP，引物，模板， 酶 dNTP，引物，模板， 酶，探针，参照 结果检测琼脂糖凝胶电泳ELISA

4、，或实时荧光检测 结果性质定性定量，或定性 结果准确性无法区别假阴性、假阳 性 有效识别假阴性假阳性 分子诊断项目课件9 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 z指在指在PCR反应体系中加入荧光基团反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号利用荧光信号 的积累实时监测的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对进程，最后通过标准曲线对 未知模板进行定量分析未知模板进行定量分析。 zCt（cycle threshold)值定义：每个反应管的荧值定义：每个反应管的荧 光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 z荧光阈值（荧光阈值（threshold)的缺省设置

5、是的缺省设置是3-15个循个循 环的荧光信号的标准偏差的环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：倍，即： threshold=10SD cycle0-15 分子诊断项目课件10 CtCt值与起始模板的关系值与起始模板的关系 z 每个模板的每个模板的CtCt值与该模板的起始拷贝数的值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系，起始模板数越多，对数存在线性关系，起始模板数越多，CtCt 值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作 出标准曲线，只要获得未知样品的出标准曲线，只要获得未知样品的CtCt值，值， 即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷即可从标准曲线上计算出该样品的起

6、始拷 贝数。贝数。 分子诊断项目课件11 荧光定量的标准曲线荧光定量的标准曲线 标准曲线 未知标本 Crossing Point (Cycles) log (copy number)n log (F2/F1) n log (F2/F1) Target 3838 分子诊断项目课件12 荧光检测模式 z（1）SYBR Green I 染料 z（2）水解探针（Taqman） z（3）杂交探针（Hybridization Probes） z（4）分子信标（molecular beacon) 发夹引物（sunrise primer) 蝎状引物（scorpion primer) 复合探针（complex

7、probes) 分子诊断项目课件13 探针的探针的5端标记一个荧光基端标记一个荧光基 团，团，3标记另一个荧光基团。标记另一个荧光基团。 5端荧光基团吸收能量后将端荧光基团吸收能量后将 能量转移给临近的能量转移给临近的3端荧光端荧光 淬灭基团（淬灭基团（FRET），正常），正常 情况下检测不到该探针情况下检测不到该探针5端端 荧光基团发出的荧光信号。荧光基团发出的荧光信号。 Taqman探针原理 分子诊断项目课件14 当溶液中模板变当溶液中模板变 性后低温退火时，性后低温退火时， 引物与探针同时引物与探针同时 与模板结合。在与模板结合。在 引物的介导下，引物的介导下， Taq酶酶沿模板向前沿模

8、板向前 合成子链，当延合成子链，当延 伸至探针结合处，伸至探针结合处， 发生链的置换；发生链的置换； Taqman探针原理 分子诊断项目课件15 Taqman探针原理 Taq酶的酶的53外切酶活性外切酶活性 将探针将探针5端连接的荧光基团端连接的荧光基团 从探针上切割下来，游离于从探针上切割下来，游离于 反应体系中，从而脱离反应体系中，从而脱离3端端 荧光淬灭基团的屏蔽，发出荧光淬灭基团的屏蔽，发出 荧光，荧光信号与荧光，荧光信号与PCR产产 物的数量成比例。因此根据物的数量成比例。因此根据 PCR反应液的荧光强度即反应液的荧光强度即 可计算出初始模板的数量。可计算出初始模板的数量。 分子诊断

9、项目课件16 定量定量PCRPCR在乙肝检测中意义在乙肝检测中意义 z1. 1. 判断疾病的严重程度和传染性判断疾病的严重程度和传染性 z2. PCR2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价结果与血清免疫学结果的综合评价 z3. 3. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量观察抗病毒药物疗效，指导药物用量 z4. 4. 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断 z5. 5. 预测病情、判断预后预测病情、判断预后 z6. 6. 器官移植、母婴垂直传播器官移植、母婴垂直传播 分子诊断项目课件17 与乙肝标志物阳性率比较 例数 HBsAg HBcIgG HBcIgM HB

10、eAg HBeAb HBsAb PCR 阳性率() . . . . . . 分子诊断项目课件18 标本留取及检测步骤标本留取及检测步骤 z标本：静脉血3ml，黄色盖试管。标本避免 溶血和脂血。 z检测步骤：1.反应液配制 2.核酸提取 3.核酸扩增 z结果分析：采用样点拟合法，由标准曲线 得到病毒的拷贝或IU/ML。 分子诊断项目课件19 z1.1.分区操作：分区操作：PCRPCR具有超敏感性，因此在检具有超敏感性，因此在检 测过程中应分区操作，即分为试剂准备区，测过程中应分区操作，即分为试剂准备区， 样品处理区，样品处理区，PCRPCR扩增区。扩增区。 z2.2.试验前实验室应使用紫外消毒至

11、少试验前实验室应使用紫外消毒至少3030分分 钟。钟。 z3.3.操作时戴一次性手套，加样头要求及时操作时戴一次性手套，加样头要求及时 更换，吸液时避免飞溅。更换，吸液时避免飞溅。 注意事项 分子诊断项目课件20 z4.4.每天实验前，在废物缸内套上塑料袋，每天实验前，在废物缸内套上塑料袋， 加入半缸含有效氯加入半缸含有效氯1%1%次氯酸钠液，实验时次氯酸钠液，实验时 将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。 z5.5.所有试剂试验前充分融化，避免反复冻所有试剂试验前充分融化，避免反复冻 融。融。 z6.6.每次每次PCRPCR反应均应设立阴阳性对照。反应均应设立阴阳性

12、对照。 注意事项 分子诊断项目课件21 流式基本应用 分子诊断项目课件22 流式细胞术的概念流式细胞术的概念 =流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry, Flow Cytometry, 简称简称FCMFCM）是一种可以快）是一种可以快 速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中 的单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技的单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技 术，同时可以对特定群体加以分选术，同时可以对特定群体加以分选 =研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微研究对象为生物颗粒，如各种细胞、

13、微生物及人工合成微 球等球等 =研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征 分子诊断项目课件23 流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围 细胞结构细胞结构 =细胞大小 =细胞颗粒度 =细胞表面面积 =核浆比例 =DNA含量与细胞周期 =RNA含量 =蛋白质含量 细胞功能细胞功能 =细胞表面/胞浆/核的 特异性抗原 =细胞活性 =细胞内细胞因子 =酶活性 =激素结合位点 =细胞受体 分子诊断项目课件24 散射光信号散射光信号 Right Angle Light Detector Right Angle Light Detector Cell Complexit

14、y Cell Complexity SSCSSC Forward Light Forward Light Detector Detector Cell Surface Area Cell Surface Area FSCFSC Incident Incident Light Light SourceSource = 前向角散射光前向角散射光（FSCFSC, Forward Scatter, Forward Scatter） 细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 = 侧向角散射光侧向角散射光（SSCSSC, Side Scatter, Side Scatter） 细胞颗粒度及细胞内细胞器

15、的相对复杂性细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性 分子诊断项目课件25 外周全血细胞散射光双外周全血细胞散射光双参数参数点图点图 （红细胞溶解后）（红细胞溶解后） 分子诊断项目课件26 荧光信号荧光信号 z使用荧光标记的单克隆抗体染色，做使用荧光标记的单克隆抗体染色，做 多色分析多色分析 z荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的 表达含量表达含量 分子诊断项目课件27 数据分析数据分析 =数据显示数据显示: : 直方图直方图 ( Histogram )( Histogram ) 二维点图二维点图(Dot Plot)(Dot Plot) 等高线图等高线图(Contour

16、 (Contour Plot)Plot) 密度图密度图 (Density)(Density) 三维图（三维图（3D Plot3D Plot） 分子诊断项目课件28 流式的临床应用流式的临床应用 = 淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析 = 白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋巴瘤的免疫分型 = 肿瘤的细胞周期和倍体分析肿瘤的细胞周期和倍体分析 = 网织红细胞计数网织红细胞计数 = 细胞移植的免疫状态监测细胞移植的免疫状态监测 = 干细胞计数干细胞计数 = 阵发性血红蛋白尿阵发性血红蛋白尿 = HLA-B27HLA-B27检查检查 = 血小板功能及相关疾病血小板功能及相关疾病 = HIVHIV免疫分型

17、，免疫分型，CD4CD4绝对计数绝对计数 分子诊断项目课件29 淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析 z使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进 行多色染色，同时分析淋巴细胞膜上多种行多色染色，同时分析淋巴细胞膜上多种 白细胞分化抗原（白细胞分化抗原（CDCD分子）的表达，可以分子）的表达，可以 将淋巴细胞亚群区分开，进行定性分析将淋巴细胞亚群区分开，进行定性分析 z各淋巴细胞亚群的百分含量各淋巴细胞亚群的百分含量 z淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析 分子诊断项目课件30 z根据功能，淋巴细胞主要分为根据功能，淋巴细胞主要分为

18、 yB B淋巴细胞（淋巴细胞（CD19+CD19+），与体液免疫有关），与体液免疫有关 yT T淋巴细胞（淋巴细胞（CD3+CD3+），与细胞免疫有关），与细胞免疫有关 x总总T T和总和总B B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性 疾病疾病 yNKNK细胞（细胞（CD3-CD16+56+CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能，），行使免疫监控功能， 能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细 胞毒性作用。胞毒性作用。 分子诊断项目课件31 y根据根据CD4CD4、CD8CD8表达，表达，T T淋巴细胞又分为淋巴细

19、胞又分为 yT T辅助辅助/ /诱导细胞（诱导细胞（CD3+CD4+CD3+CD4+），即），即 Th/TiTh/Ti yT T抑制抑制/ /细胞毒性细胞（细胞毒性细胞（CD3+CD8+CD3+CD8+）, ,即即 Ts/TcTs/Tc yTh/TsTh/Ts比值比值 可用于评价自身免疫失调、被怀可用于评价自身免疫失调、被怀 疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免 疫状态疫状态 分子诊断项目课件32 临床意义 z诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无 r 球蛋白血球蛋白血 症）或继发性免疫缺陷病（如症）或继发性免疫缺陷病（如A

20、IDS） z造血干细胞移植后免疫重建（造血干细胞移植后免疫重建（6个月个月NK ；9个月个月 T、B ） zTh/TsTh/Ts ：机体免疫功能亢进机体免疫功能亢进：自身免疫性疾病，自身免疫性疾病， 如如SLESLE、类风湿性关节炎等（治疗有效恢复正常）、类风湿性关节炎等（治疗有效恢复正常） zTh/TsTh/Ts ：机体免疫功能低下机体免疫功能低下：AIDSAIDS、病毒感染、病毒感染、 慢性活动性肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、慢性活动性肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、 肿瘤等肿瘤等 分子诊断项目课件33 临床意义 z移植后动态免疫监测：移植后动态免疫监测： y急排临床症状出现前急排临床症

21、状出现前1-51-5天，活化天，活化T T和和Th/TsTh/Ts持续持续 ， 1.21.2预示急排；预示急排； yTh/TsTh/Ts持续持续 表明可能感染，比值表明可能感染，比值1.081.08，可能性大，可能性大， 0.20.2应停用免疫抑制剂；应停用免疫抑制剂； z实体肿瘤疗效和病人免疫状态观察实体肿瘤疗效和病人免疫状态观察 y治疗前常伴治疗前常伴T T 、Th/TsTh/Ts ，放，放/ /化疗有效可恢复；化疗有效可恢复； y淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常 较好；较好； z探索疾病发病机理、进程和预后（炎症、肿瘤）探索疾病

22、发病机理、进程和预后（炎症、肿瘤） 分子诊断项目课件34 淋巴细胞亚群双色分析淋巴细胞亚群双色分析 分子诊断项目课件35 先天性无先天性无 r r 球蛋白血症球蛋白血症 分子诊断项目课件36 淋巴细胞亚群双色分析淋巴细胞亚群双色分析 分子诊断项目课件37 HLA-B27HLA-B27 HLA-B27HLA-B27是是MHC IMHC I类抗原，在有核细胞上广泛表达类抗原，在有核细胞上广泛表达 HLA-B27HLA-B27的表达与强直性脊柱炎高度相关，超过的表达与强直性脊柱炎高度相关，超过90%90%的强的强 直性脊柱炎患者直性脊柱炎患者HLA-B27HLA-B27阳性。阳性。 其他，如其他，如

23、Reiter sReiter s综和症阳性率综和症阳性率70-90%70-90%，银屑病性关节，银屑病性关节 炎阳性率炎阳性率50-60%50-60%，葡萄膜炎阳性率，葡萄膜炎阳性率40-50%40-50% 检测采用全血，无需分离淋巴细胞，操作简单，可以快速、检测采用全血，无需分离淋巴细胞，操作简单，可以快速、 灵敏、准确地分析灵敏、准确地分析HLA-B27HLA-B27。 结果报告检测的平均荧光强度，根据界值判定，得到阴结果报告检测的平均荧光强度，根据界值判定，得到阴 性性/ /阳性结果。实验的灵敏度为阳性结果。实验的灵敏度为100%100%，特异性为，特异性为97.5%97.5%。 分子诊

24、断项目课件38 流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用（血液（血液） z 白血病和淋巴瘤免疫分型白血病和淋巴瘤免疫分型 z 造血干细胞计数造血干细胞计数 z 阵发性血红蛋白尿（阵发性血红蛋白尿（PNHPNH）诊断）诊断 z 网织红细胞计数网织红细胞计数 z 血小板分析血小板分析 y血小板膜糖蛋白分子的表达血小板膜糖蛋白分子的表达 y血小板活化血小板活化 y网织血小板分析网织血小板分析 分子诊断项目课件39 流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用（肿瘤）（肿瘤） z 细胞周期和倍体分析细胞周期和倍体分析 z 肿瘤相关基因表达肿瘤相关基因表达的研究的研究 z 抗肿瘤药物作用机制的研究抗肿瘤药物作用机制的研究

25、z 放疗放疗/ /化疗疗效的研究化疗疗效的研究 z 多药耐药基因多药耐药基因的研究的研究 z 细胞凋亡的分析细胞凋亡的分析 y凋亡细胞的分析凋亡细胞的分析 y凋亡相关蛋白凋亡相关蛋白的分析的分析 分子诊断项目课件40 流式标本留取 z 紫色盖试管，EDTA抗凝血或骨髓1-2ml。 不能有凝块。 z 单细胞悬液细胞数不少于106个。 分子诊断项目课件41 染色体核型分析染色体核型分析 分子诊断项目课件42 基本概念 z 染色体核型：染色体核型：指一个物种所特有的染色体数目和每一条染指一个物种所特有的染色体数目和每一条染 色体的形态特征。色体的形态特征。-人类体细胞中共有人类体细胞中共有2323对

26、染色体，对染色体， 2222对常染色体，一对性染色体。对常染色体，一对性染色体。 z 核型分析：核型分析：将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特征将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特征 分析的过程称核型分析。如正常女性核型：分析的过程称核型分析。如正常女性核型：46,XX 46,XX 正常正常 男性核型：男性核型：4646，XYXY。 z 核型模式图：核型模式图：是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其 特征绘制下来，再按长短、形态特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。等特征排列起来的图像。 分子诊断项目课件43 染色体模式图 分子诊断项目课件

27、44 人类23对染色体 分子诊断项目课件45 分子诊断项目课件46 染色体编号(人X染色体) 记述一特定带时，需要写明4个内 容：染色体号，长短臂，区的 号序和带的号序。这些内容按 顺序写，不用间隔或加标点。 如果某一带被再细分，在原带 号数后加一小数点，编号原则 仍按从着丝粒往臂端序贯编号。 如1p31.2代表一号染色体短臂 3区1带第2亚带 分子诊断项目课件47 染色体标本常规制备染色体标本常规制备 z方法方法 ：中期染色体G带显色 z原理原理 ：采用秋水仙素处理培养的细胞，使 细胞停留在分裂中期，再用低渗液处理细 胞，使细胞胀大，以进行染色体制片。G- 带是标本片经过预处理后，用Giem

28、sa染色 显示的带纹。 分子诊断项目课件48 操作步骤 z 细胞培养：细胞培养： 细胞培养液5mL（含植物凝血素）， 加 0.3mL肝素抗凝全血37培养箱静置培养68 72小时。 z 收获细胞：收获细胞： 终止培养前11.5小时加入秋水仙素。 z 制片：制片：低渗-预固定-固定-滴片-干燥老化 z G-显带，图像分析：胰酶消化， Giemsa染色，采 集图像，分析20-30个中期分裂相 分子诊断项目课件49 核型描述 z 首先列出染色体总数，然后是性染色体组成，接着列出异 常的染色体数目或形态。下列统一的命名符号： yA-G 染色体组的名称 y1-22 染色体编号 yX,Y 性染色体 ydel 缺失 yder 结构重排的染色体 ydup 重复 yi