流式细胞术原理及树突状细胞的检测

1、流式细胞术原理及树突状细胞的检测 概念 t流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） t利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态 中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量 分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分 析技术。 t流式细胞仪（Flow Cytometer) t使细胞（或其他粒子）以单个方式依次高速通 过激发光束，采集细胞被光照时产生的各种信 号，对信号进行处理，并对各参数进行关联分 析的一种仪器。 功能特点 （）单细胞（血液，细胞株，消化后实体瘤细 胞 （2）多参数定量分析 （3）高通量、更敏感、更准确 分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒 （4）细胞分选

2、高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群、 单细胞克隆等 Epics XL-ADC:最经典的分析型台式小机型:世界上第一台单激 光四色机型，全矩阵荧光补偿，数字式流式细胞仪 Epics Altra：最方便稳定的分析型分选型兼顾的大型流式分选 机：最稳定、最灵活的高活性收获细胞的分选机 Cytomics FC500最新的包含多种高新技术的多色分析机 ：第一台单激光5色机型，高灵敏度，全自动化设置 检测对象 悬浮在溶液中的0.2uM-300uM相互离散颗粒。 对象举例 细胞类型： （1）高等真核细胞； （2）酵母； （3）细菌； （4）多细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒：

3、 细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳 化微球等。 临床研究 t淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞 分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析 、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细 胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、 flow-FISH法测定端粒长度 基础研究 淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血 干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、 凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药 基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、 RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑 癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究 基本原理 t光源 t488nm兰绿色，15mW空冷，氩

4、离子激光或633nm氦氖激 光 t标本台 t流动室(flow cell) l鞘液SHEATH：(ISOTON II, III) PBS l无颗粒，无荧光本底 l无菌，稳定的pH l样本流SAMPLE 单细胞悬液51051106个/ml t放大部分 t光电倍增管PMT HV t放大电路 GAIN 增益 l线性：LIN l对数：LOG t统计：计算机 FLOW CELL Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid FLOW CYTOMETRY(FCM) PMTAMP computer LIN LOG LASER

5、 SAMPLE SIGNAL 常用荧光染料的特性 t荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 tFITC 488 525 免疫荧光 绿 色 tPE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 tECD 488 620 免疫荧光 橙 红 tPeCy5 488 675 免疫荧光 深 红 tPI 488 620 DNA染色 橙 红 滤片 t带通滤片 BAND PASS (BP) t只允许某些波长的光通过 t二向色性滤片 DICHROIC FILTER t一定波长以上通过，该波长以下折射 630 nm BandPass Filter Transmitted Light White Li

6、ght Source 620 -640 nm Light Dichroic Filter/Mirror at 45 deg Reflected light Transmitted LightLight Source OPTICS 细胞分选系统 Fluorescence Activated Cell Sorting 488 nm laser +- Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Sensor Fluorescence detector 信号 t荧光信号 tFL1，FL2，FL3， FL4 t线性，对数 t散射光信号

7、t前向散射光(FS)： 细胞大小 t侧向散射光(SS)： 结构复杂程度 直方图(HISTOGRAM)与 点图(DOT PLOT) FL COUNT FL1 FL2 HISTOGRAMDOT PLOT GATE设门 t界定分析区域：REGION t十字门：QUA t矩形门：REC t自由门：AMO t线性门：LIN t建立直方图之间的关系 A A A 方案PROTOCOL t选定参数 t构建直方图 t区域，GATE， t停止，存储，打印 t放大倍数，阈值，流速。 免疫荧光(IMMUNOPHENITYPING) 单标记 t参数：FS Lin, SS Lin, FL Log t直方图： t同型对照(

8、ISOTYPE)：同抗体类型、同荧光染料 t 非抗人 SS FS FL COUNT 11024 A A SAMPLE + ISOTYPE SAMPLE + CD4 免疫荧光(IMMUNOPHENITYPING) 双标记 t参数：FS Lin, SS Lin, FL1 Log, FL2 LOG t 直方图： t同型对照 t颜色补偿 FS SS FL 1FL 2 FL 2 COUNT COUNT FL 1 A AAA 11 1 1 10241024 光谱交叉 荧光补偿 PMT1 放大放大1 PMT2 放大放大2 计算机 525nm575nm FL!FL! FL2 FL2 全矩阵颜色补偿 最先进的方

9、法是利用软件进行全矩阵颜色补偿（任何两个荧光检测通道最先进的方法是利用软件进行全矩阵颜色补偿（任何两个荧光检测通道 之间都可以进行补偿）之间都可以进行补偿） 树突状细胞流式检测特点 （1）体积较大，表面多突起，容易吸附非特异荧 光。 （2）未成熟DC有很强的吞噬功能，容易吞噬游离 荧光分子，易检测到假阳性。 （3）吸附能力较强，容易堵塞流动池（ FLOW CELL）。 外周血树突状细胞的检测 t五色分析DC表达:CD(14+16)-FITC, CD85k(ILT3)- PE, CD45-ECD, CD33-PC5, CD2-PC7. t同时检测和区分MDC和PDC 人外周血中诱导扩增DC的表型分析 tPBMC在加入GM-CSF及IL-4诱导的未成熟DC表型 t加入TNF-诱导的成熟DC表型 DC的表型变化 （）CD1a, CD40, CD80, CD83, CD86为人外周 血中诱导扩增DC的主要表型检测指标。 （）CD40, CD80, CD86在DC表面高表达。 （）未成熟DC表面高表达CD1a。 （）成熟DC表面高表达CD83。 DC标记检测注意事项 t（）因DC在低温环境下吞噬能力下降显著， 标记前细胞应在4预冷，荧光抗