细胞培养学课件：第三章体外培养物的细胞生物学

1、第三章第三章 体外培养物体外培养物 的细胞生物学的细胞生物学 体外培养物的生物学特征具有两重性，一方面体外培养物的生物学特征具有两重性，一方面 细胞来源于体内，其基本生物学特征仍与体内细胞细胞来源于体内，其基本生物学特征仍与体内细胞 相似，乃所谓相似，乃所谓“万变不离其宗万变不离其宗”。另一方面，生长。另一方面，生长 环境与体内相比又有很大差别，尤其是失去在体内环境与体内相比又有很大差别，尤其是失去在体内 时有机整体的调节机制，许多生物学行为发生改变，时有机整体的调节机制，许多生物学行为发生改变， 如形态结构和增殖规律等，此为如形态结构和增殖规律等，此为“入乡随俗入乡随俗”。 体外培养细胞生物

2、学，即有关细胞在体外培养体外培养细胞生物学，即有关细胞在体外培养 条件下的细胞生物学行为，具有其本身的特点和规条件下的细胞生物学行为，具有其本身的特点和规 律。律。 第第1节节 体外培养细胞的生物学特点体外培养细胞的生物学特点 体外培养细胞源于体内，基本的生物学规体外培养细胞源于体内，基本的生物学规 律和体内相同，但与体内又有差别。律和体内相同，但与体内又有差别。 体内、外细胞的增殖方式相同，均依赖于体内、外细胞的增殖方式相同，均依赖于 有丝分裂，其有丝分裂，其差异的关键在于细胞的分化差异的关键在于细胞的分化，细，细 胞分化是检测细胞差异的核心问题。胞分化是检测细胞差异的核心问题。 一、一、

3、培养细胞分化状态的变化培养细胞分化状态的变化 体内细胞在生长发育过程中，始终受到三方面的影响和调体内细胞在生长发育过程中，始终受到三方面的影响和调 节：体外环境的影响；体内神经节：体外环境的影响；体内神经-体液因素的调节；细胞与局体液因素的调节；细胞与局 部微环境的相互作用。部微环境的相互作用。 （一）体内外细胞差异（一）体内外细胞差异 体外培养细胞由于失去动态平衡的相对稳定的环境，易体外培养细胞由于失去动态平衡的相对稳定的环境，易 发生各种改变，主要表现为：发生各种改变，主要表现为： 失去原有的组织结构和细胞形态失去原有的组织结构和细胞形态 分化特征减弱或不显，原来各种各样的分化细胞，逐渐分

4、化特征减弱或不显，原来各种各样的分化细胞，逐渐 失去各自的形态与功能失去各自的形态与功能“个性个性”，形态和功能趋于单一化，形态和功能趋于单一化， 出现类似出现类似“返祖返祖”现象。现象。 发生转化，获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。发生转化，获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。 细胞增殖和分化是细胞生命进化中获得的基本属性。细胞增殖和分化是细胞生命进化中获得的基本属性。 组成人体结构、功能和生长发育的基本单位的细胞，是组成人体结构、功能和生长发育的基本单位的细胞，是 已发生了高度分化的成分。表现在人体细胞与细胞间呈已发生了高度分化的成分。表现在人体细胞与细胞间呈 现着高度的相互依存

5、性、和个体细胞相对失去独立性。现着高度的相互依存性、和个体细胞相对失去独立性。 从受精卵形成开始，细胞的两个基本过程增殖和分化，从受精卵形成开始，细胞的两个基本过程增殖和分化， 便协调地进行着。增殖使细胞数量增多，分化使机体结便协调地进行着。增殖使细胞数量增多，分化使机体结 构和功能多样化，最终演变形成完整的人体。每个细胞构和功能多样化，最终演变形成完整的人体。每个细胞 的生命活动均听命于外源信号的生命活动均听命于外源信号(来自其他细胞来自其他细胞)，通过相关，通过相关 基因的调控，使之发生增殖或分化的表达。当细胞被离基因的调控，使之发生增殖或分化的表达。当细胞被离 体培养后，信号来源切断，特

6、定基因分化表达减弱或停体培养后，信号来源切断，特定基因分化表达减弱或停 止。而进化中保守的细胞增殖活动却可维持，遂使体内止。而进化中保守的细胞增殖活动却可维持，遂使体内 外细胞出现了差异。外细胞出现了差异。 (二二)培养细胞的分化培养细胞的分化 细胞分化机制极其复杂，是在细胞与细胞、细胞分化机制极其复杂，是在细胞与细胞、 细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下，由细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下，由 众多基因参与、经过多阶段和多环节完成的动态众多基因参与、经过多阶段和多环节完成的动态 演变过程。细胞离体培养后，失掉上述在体内时演变过程。细胞离体培养后，失掉上述在体内时 的关系，细胞的分化

7、可能发生以下变化的关系，细胞的分化可能发生以下变化： 1不适应不适应：表现为细胞原有的分化特性减弱或不：表现为细胞原有的分化特性减弱或不 显。是因生存条件的改变使分化发生抑制。显。是因生存条件的改变使分化发生抑制。 2. 去分化或脱分化（去分化或脱分化（Dedifferentiation):即细胞失即细胞失 掉发生分化的能力。可能是基因变异所致。掉发生分化的能力。可能是基因变异所致。 3体外培养细胞具有分化潜能。体外培养细胞具有分化潜能。很多细胞仍呈现很多细胞仍呈现 一定程度的分化表达现象。与体内条件越近似，细胞一定程度的分化表达现象。与体内条件越近似，细胞 越易发生分化。越易发生分化。 4细

8、胞离体培养时间越长，分化能力越弱，细胞离体培养时间越长，分化能力越弱，二者二者 呈反向关系。呈反向关系。 5细胞恶变的本质是细胞增殖和分化调控的失控，细胞恶变的本质是细胞增殖和分化调控的失控， 诱导癌细胞发生分化是癌细胞逆转的表现。诱导癌细胞发生分化是癌细胞逆转的表现。 二二. 体外培养细胞的形态学体外培养细胞的形态学 与体内细胞基本相同，形态趋化单一化与体内细胞基本相同，形态趋化单一化 (一一) 大体形态大体形态 1.悬浮型悬浮型 悬浮生长，不论细胞何种来源，胞体悬浮生长，不论细胞何种来源，胞体 均呈球形。均呈球形。 2.贴附型贴附型 贴附于支持物后，开始仍为圆形，很快贴附于支持物后，开始仍

9、为圆形，很快 演变过渡成扁平形态。演变过渡成扁平形态。 通常经通常经0.52h放射延展放射延展 细胞细胞 (Radial Spread cell) 极性细胞极性细胞(Polarized cell) (纺锤形、三角形或不规则多角形等多种形态纺锤形、三角形或不规则多角形等多种形态) 3. 光镜下特点光镜下特点 一般光镜下主要观察均质性和透明度。一般光镜下主要观察均质性和透明度。 健康的活细胞是均质透明的，结构极不明健康的活细胞是均质透明的，结构极不明 显，可观察到核仁，细胞轮廓和内部结构不清。显，可观察到核仁，细胞轮廓和内部结构不清。 相差显微镜可观察到细胞轮廓和内部结构。细相差显微镜可观察到细胞

10、轮廓和内部结构。细 胞代谢不良或衰老时，细胞轮廓明显，反差加胞代谢不良或衰老时，细胞轮廓明显，反差加 大，胞质中出现颗大，胞质中出现颗 粒、脂滴和空泡等，反差很粒、脂滴和空泡等，反差很 大大 的暗色小颗粒是变形的线粒体。的暗色小颗粒是变形的线粒体。 细胞形态结构与细胞在体外生存时间的长细胞形态结构与细胞在体外生存时间的长 短、种类等有直接关系。短、种类等有直接关系。 (二二) 超微结构超微结构 1.透射电镜下，通常观察不到与在体细胞的透射电镜下，通常观察不到与在体细胞的 形态结构有明显差异，包括各种亚细胞结构。形态结构有明显差异，包括各种亚细胞结构。 2.扫描电镜：与在体细胞有较大差别，主要扫

11、描电镜：与在体细胞有较大差别，主要 在外形上。应用电镜可以观察到不同类型细胞的在外形上。应用电镜可以观察到不同类型细胞的 特征性结构，明确细胞来源。特征性结构，明确细胞来源。 三、体外培养细胞的增殖能力三、体外培养细胞的增殖能力 体外培养细胞的两大生命特征是分化增殖和体外培养细胞的两大生命特征是分化增殖和 生长发育。生长发育。 1. 培养细胞的增殖能力一般与该种细胞在培养细胞的增殖能力一般与该种细胞在 体内的增殖能力相仿。体内的增殖能力相仿。 2. 胚胎细胞胚胎细胞成年组织细胞。成年组织细胞。 3. 高度分化的细胞通常增殖能力较弱。高度分化的细胞通常增殖能力较弱。 4. 恶性肿瘤细胞可在体外无

12、限传代。恶性肿瘤细胞可在体外无限传代。 第第2节节 体外培养细胞的生长类型体外培养细胞的生长类型 根据培养细胞是否贴附在支持物上生长的特性，根据培养细胞是否贴附在支持物上生长的特性， 分为两大类：分为两大类： 一、贴附型细胞一、贴附型细胞 大多数培养细胞属之，只有贴附在支持物上才能生长的细大多数培养细胞属之，只有贴附在支持物上才能生长的细 胞称贴附型细胞或锚着依存性细胞胞称贴附型细胞或锚着依存性细胞(anchorage-dependent cells)。 这些细胞在体外环境中需要贴附于某固相表面才能生存和生长，这些细胞在体外环境中需要贴附于某固相表面才能生存和生长， 易失去它们在体内时原有的特

13、征，易失去它们在体内时原有的特征，细胞分化现象常变得不显著细胞分化现象常变得不显著。 形态上常表现为单一化的现象，并常反映其胚层起源，呈现类形态上常表现为单一化的现象，并常反映其胚层起源，呈现类 似似“返祖现象返祖现象”。来源于内、外胚层的细胞多呈上皮型，中胚来源于内、外胚层的细胞多呈上皮型，中胚 层的易呈成纤维型。供体越幼稚层的易呈成纤维型。供体越幼稚“返祖返祖”越明显。越明显。 贴附有两方面含义，一是细胞与细胞之间的接触，二是贴附有两方面含义，一是细胞与细胞之间的接触，二是 细胞与细胞外基质的结合。体内细胞的粘附是全方位的，细胞与细胞外基质的结合。体内细胞的粘附是全方位的， 具有复杂的立体

14、特征，体外培养细胞贴附的支持物为一平具有复杂的立体特征，体外培养细胞贴附的支持物为一平 面。面。体外培养细胞形态常表现有单一化的倾向，因此在判体外培养细胞形态常表现有单一化的倾向，因此在判 定细胞形态时，很难再按体内细胞标准确定，只能大致分定细胞形态时，很难再按体内细胞标准确定，只能大致分 类：类： 1.成纤维细胞型成纤维细胞型 形态与体内成纤维细胞形态相似，胞体呈梭形，长形态与体内成纤维细胞形态相似，胞体呈梭形，长 条形或不规则三角形，核呈卵圆形，胞质向外伸出条形或不规则三角形，核呈卵圆形，胞质向外伸出23个个 长短不同的突起。生长时多呈放射状、火焰状或旋涡状走长短不同的突起。生长时多呈放射

15、状、火焰状或旋涡状走 行。除真正的成纤维细胞外，凡起源于中胚层的细胞在体行。除真正的成纤维细胞外，凡起源于中胚层的细胞在体 外培养时，一般表现这种形式，如心肌、平滑肌、成骨细外培养时，一般表现这种形式，如心肌、平滑肌、成骨细 胞、血管内皮等。此外在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞、血管内皮等。此外在培养中的细胞凡形态与成纤维细 胞类似时，皆可称为成纤维细胞。胞类似时，皆可称为成纤维细胞。 成纤维细胞成纤维细胞 1.细胞种类：单个成纤维细胞；细胞种类：单个成纤维细胞； 2.培养天数：原代后培养培养天数：原代后培养2天；天； 3.放大倍放大倍 数：数：1010； 4.培养基种类：培养基种类：DMEM

16、+10%FBS； 5.细胞状态与特征简述：细胞状态与特征简述： 细长梭形。细长梭形。 新生新生SD大鼠肺成纤维细胞大鼠肺成纤维细胞(原代原代)： 1.细胞种类：鼠肺成纤维细胞；细胞种类：鼠肺成纤维细胞； 2.培养天数：培养天数：48h；3.放大倍数：放大倍数：1010； 4.培养基种类：培养基种类：RPMI1640+10%小牛血清；小牛血清；5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞呈梭细胞呈梭 形，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长。形，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长。 NIH3T3细胞细胞 1.细胞种类：小鼠成纤维细胞；细胞种类：小鼠成纤维细胞； 2.培养天数：传代后培养天数：传代后48h

17、； 3.放大倍数：放大倍数： 1010 ； 4.培养基种类：培养基种类：DMEM+10%胎牛血清；胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞状态与特征简述： 细胞贴壁生长，呈梭形，生长速度快，细胞贴壁生长，呈梭形，生长速度快，3d传一次代，美国国立卫生研究院传一次代，美国国立卫生研究院 首先建系，故命此名。首先建系，故命此名。 NIH3T3细胞细胞 1.细胞种类：细胞种类：Swiss小鼠胚胎成纤维细胞；小鼠胚胎成纤维细胞； 2.培养天数：传代后培养天数：传代后48h； 3. 放大倍数：放大倍数：1010；4.培养基种类：培养基种类：DMEM+10%小牛血清；小牛血清；5.细胞状态与特细胞状态与特

18、征简述：细胞贴壁生长，呈梭形，生长速度快，征简述：细胞贴壁生长，呈梭形，生长速度快，3d传一次代，美国国立卫生传一次代，美国国立卫生 研究院研究院(National Institute of Health)建立。建立。 NIH3T3 1. 细胞种类：小鼠胚胎成纤维细胞；细胞种类：小鼠胚胎成纤维细胞；2. 培养天数：培养天数：4d；3. 放大倍数：放大倍数： 1010；倒置显微镜；倒置显微镜；4. 培养基种类：培养基种类：RPMI1640+10%小牛血清；小牛血清；5. 细胞细胞 状态与特征简述：细胞呈长梭形，贴壁生长。状态与特征简述：细胞呈长梭形，贴壁生长。 Fibroblast细胞：贴细胞：

19、贴 壁壁23天的细胞天的细胞 1.细胞种类：人肺部成纤维细胞；细胞种类：人肺部成纤维细胞；2.培养天数：培养天数：1d - 2d -3d；3.放大倍数：放大倍数： 200倍；倍；4.培养基种类：培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清；胎牛血清；5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述: 细胞呈梭形，贴壁生长。细胞呈梭形，贴壁生长。 NIH3T3细胞转染绿色荧光蛋白基因后细胞转染绿色荧光蛋白基因后 2.上皮型细胞上皮型细胞： 起源于内胚层和外胚层的细胞，体外培养时基本都呈起源于内胚层和外胚层的细胞，体外培养时基本都呈 现上皮型。如皮肤的表皮、消化道及呼吸道上皮细胞、血现上皮型。如皮肤的表皮

20、、消化道及呼吸道上皮细胞、血 管内皮细胞、肝、胰和肺泡上皮等组织，以及上皮源性的管内皮细胞、肝、胰和肺泡上皮等组织，以及上皮源性的 鳞癌细胞等。并非所有鳞癌细胞等。并非所有内胚层和外胚层来源的细胞体外培内胚层和外胚层来源的细胞体外培 养时都呈上皮型细胞，如神经细胞起源于外胚层，但在培养时都呈上皮型细胞，如神经细胞起源于外胚层，但在培 养时不呈上皮型。养时不呈上皮型。 形态学特征：呈扁平不规则多角形，中央有形态学特征：呈扁平不规则多角形，中央有 圆形核，细胞紧密相连成单层膜，细胞增殖数量圆形核，细胞紧密相连成单层膜，细胞增殖数量 多时，多时，生长时整块膜随之移动生长时整块膜随之移动；处于上皮膜边

21、缘；处于上皮膜边缘 的细胞多与膜相连，很少脱落细胞群单独活动。的细胞多与膜相连，很少脱落细胞群单独活动。 “铺路石样铺路石样”：细胞紧密排列时，细胞呈多角形细胞紧密排列时，细胞呈多角形 或六角形；或六角形； “拉网现象拉网现象”(Netting)：在构成上皮细胞膜状生在构成上皮细胞膜状生 长的细胞群中一些细胞常相互分离卷曲，致使上长的细胞群中一些细胞常相互分离卷曲，致使上 皮细胞膜中形成网眼状空洞。可能与细胞分泌透皮细胞膜中形成网眼状空洞。可能与细胞分泌透 明质酸酶有关。明质酸酶有关。 上皮细胞的拉网现象上皮细胞的拉网现象 1.细胞种类：细胞种类：HeLa细胞；细胞；2.培养天数：培养培养天数

22、：培养2天；天；3.放大倍数：放大倍数： 200； 4.培养基种类：培养基种类：DMEM+10%小牛血清；小牛血清； 5.细胞状态与细胞状态与 特征简述特征简述:细胞贴壁生长细胞贴壁生长。 Hep-2细胞：细胞： 1.细胞种类：人喉癌上皮细胞；细胞种类：人喉癌上皮细胞；2.培养天数：培养天数：2d，细胞倍增时间，细胞倍增时间 -24h左右；左右；3.放大倍数：倒置显微镜放大倍数：倒置显微镜 100倍倍 ；4.培养基种类：培养基种类： RPMI1640+10%胎牛血清；胎牛血清；5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述:细胞低密度时呈细胞低密度时呈 梭状生长，高密度时呈上皮状。梭状生长，高密度时

23、呈上皮状。 人支气管上皮细胞人支气管上皮细胞 1.细胞种类：人支气管上皮细胞；细胞种类：人支气管上皮细胞；2.培养天数：组织块培养第培养天数：组织块培养第10天天,第第 1次传代前；次传代前；3.放大倍数：放大倍数： X100；4.培养基种类：培养基培养基种类：培养基-BEGM(含人表含人表 皮生长因子皮生长因子hEGF)、牛胰岛素、转铁蛋白、三碘甲状腺素、氢化可的松、牛胰岛素、转铁蛋白、三碘甲状腺素、氢化可的松、 视黄酸、肾上腺素、小牛垂体提取物等添加物视黄酸、肾上腺素、小牛垂体提取物等添加物) 5.细胞状态与特征简述细胞状态与特征简述: 贴贴 壁生长，扁平呈多边形，长满后呈壁生长，扁平呈多

24、边形，长满后呈“铺路石铺路石”样分布，可通过免疫组化样分布，可通过免疫组化 证实细胞角蛋白表达阳性进行鉴定。证实细胞角蛋白表达阳性进行鉴定。 HK-2细胞：细胞： 1.细胞种类：近端肾小管上皮细胞；细胞种类：近端肾小管上皮细胞；2.培养天数：培养天数：48h；3.放大放大 倍数：相差显微镜倍数：相差显微镜 X10 ； 4.培养基种类：培养基种类：RPMI1640+10%胎牛胎牛 血清；血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈鹅卵石样贴壁生长，紧密细胞状态与特征简述：细胞呈鹅卵石样贴壁生长，紧密 排列。排列。 3.游游走型细胞：走型细胞：细胞在支持物散在生长，一般不细胞在支持物散在生长，一般不 连成

25、片，细胞经常伸出伪足或突起，处于较活跃的连成片，细胞经常伸出伪足或突起，处于较活跃的 变形和游走状态，在培养器皿壁上的位置不固定，变形和游走状态，在培养器皿壁上的位置不固定， 因此外形不规则且不断变化。细胞内易出现色暗的因此外形不规则且不断变化。细胞内易出现色暗的 吞噬性颗粒，不稳定，有时难以与其他型细胞区别。吞噬性颗粒，不稳定，有时难以与其他型细胞区别。 一定条件下，细胞密度大连接成片后，游走受限，一定条件下，细胞密度大连接成片后，游走受限， 可呈类似上皮型细胞或成纤维细胞型的细胞。可呈类似上皮型细胞或成纤维细胞型的细胞。 表现这种形态的主要是具有吞噬作用的单核巨表现这种形态的主要是具有吞噬

26、作用的单核巨 噬细胞系统的细胞，如淋巴细胞、单核细胞、巨噬噬细胞系统的细胞，如淋巴细胞、单核细胞、巨噬 细胞以及某些肿瘤细胞属之。细胞以及某些肿瘤细胞属之。 小鼠单核细胞小鼠单核细胞-巨噬细胞巨噬细胞 1.细胞种类：细胞种类：RAW264.7；2.培养天数：培养天数：2d；3.放大倍数：放大倍数：1010；4. 培养基种类：培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清；胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞细胞状态与特征简述：细胞 呈梭形，半贴壁生长；右图示转染绿色荧光蛋白后荧光显微镜视图。呈梭形，半贴壁生长；右图示转染绿色荧光蛋白后荧光显微镜视图。 4.多形型细胞：是形态上不规则的细胞，无明

27、显多形型细胞：是形态上不规则的细胞，无明显 的规律且不稳定。细胞一般分胞体和胞突两部分，的规律且不稳定。细胞一般分胞体和胞突两部分， 胞突为长型，似丝状伪足，体外培养中最常见的多胞突为长型，似丝状伪足，体外培养中最常见的多 形型细胞是神经元和神经胶质细胞。形型细胞是神经元和神经胶质细胞。 注意：注意： 培养细胞的形态分类，主要是根据在培养中的表培养细胞的形态分类，主要是根据在培养中的表 现和描述上的方便。现和描述上的方便。 体外培养细胞的形态易受多种因素的影响而改变。体外培养细胞的形态易受多种因素的影响而改变。 胚胎胚胎15天天Wistar大鼠脊髓神经细胞大鼠脊髓神经细胞 1.细胞种类：大鼠脊

28、髓神经细胞；细胞种类：大鼠脊髓神经细胞； 2.培养天数：培养天数：72h；3.放大倍放大倍 数：数：200倍；倍；4.培养基种类：高糖培养基种类：高糖DMEM+10%胎牛血清；胎牛血清；5.细细 胞状态与特征简述：细胞呈梭形或圆形，有突起，贴壁生长。胞状态与特征简述：细胞呈梭形或圆形，有突起，贴壁生长。 原代神经细胞原代神经细胞 1.细胞来源：新生细胞来源：新生24h内内Wistar大鼠大脑皮质；大鼠大脑皮质；2. 培养天数：培养天数：9天；天；3. 放放 大倍数：倒置显微镜大倍数：倒置显微镜400；4. 培养基种类：培养基种类：DMEM1%N310马马 血清血清 神经元神经元 1.细胞种类：

29、原代大鼠脑皮质神经元；细胞种类：原代大鼠脑皮质神经元；2.培养天数：原代培养天数：原代3d；3.放大倍数：放大倍数： X100；4.培养基种类：培养基种类：DMEM/F12+2%B27；5. 细胞状态与特征简述：细细胞状态与特征简述：细 胞体折光性强，核仁明显，突起较多，并且互相交织成网状。胞体折光性强，核仁明显，突起较多，并且互相交织成网状。 二、悬浮型细胞二、悬浮型细胞 细胞体外培养时不贴附在支持物上，而呈悬浮细胞体外培养时不贴附在支持物上，而呈悬浮 状态生长，胞体始终为球形。如某些癌细胞和血液状态生长，胞体始终为球形。如某些癌细胞和血液 细胞。细胞。 特点：观察时不如贴附细胞方便。特点：

30、观察时不如贴附细胞方便。 细胞生存空间较大，可长时间生长，培细胞生存空间较大，可长时间生长，培 养效率高，适合大规模培养，便于做细胞代谢研究。养效率高，适合大规模培养，便于做细胞代谢研究。 培养时操作容易培养时操作容易 注意：贴附型细胞和悬浮型细胞不是一成不变注意：贴附型细胞和悬浮型细胞不是一成不变 的，一定条件下悬浮型细胞可贴壁生长而贴壁型细的，一定条件下悬浮型细胞可贴壁生长而贴壁型细 胞也可呈悬浮生长。胞也可呈悬浮生长。 第第3节节 体外培养细胞的生长和增殖过程体外培养细胞的生长和增殖过程 传代传代(passage)：细胞增殖达到一定密度时，需要分离细胞增殖达到一定密度时，需要分离 出部分

31、细胞并更换新营养液，适应细胞的继续生长和出部分细胞并更换新营养液，适应细胞的继续生长和 增殖，这一过程称为增殖，这一过程称为传代传代。 一一. 培养细胞的生命期培养细胞的生命期(Life Span of Culture Cells) 指细胞在体外培养中持续增殖和生长的时间，与指细胞在体外培养中持续增殖和生长的时间，与 细胞的种类、生物学性状和供体的年龄等因素有关。细胞的种类、生物学性状和供体的年龄等因素有关。 (一一) 原代培养期原代培养期(primary culture) 有称初代培养，有称初代培养，是指从活体内取出组织细胞开始体是指从活体内取出组织细胞开始体 外培养到第外培养到第1次进行传

32、代之前的时期，一般持续次进行传代之前的时期，一般持续14周。周。 特点：特点： 1.细胞群是异质性的细胞群是异质性的(heterogeneous)，即各细胞的遗，即各细胞的遗 传性状互不相同，相互依存性强。传性状互不相同，相互依存性强。 2.细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛，细细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛，细 胞的结构和功能与体内仍很相似。胞的结构和功能与体内仍很相似。 3.克隆形成率低克隆形成率低 4. 来源正常组织的细胞多呈二倍体核型。来源正常组织的细胞多呈二倍体核型。 5.是检测药物作用很好的实验对象。是检测药物作用很好的实验对象。 ( (二二) ) 传代期传代期 传

33、代是原代培养物贴壁生长长满培养器皿的传代是原代培养物贴壁生长长满培养器皿的 生长面或悬浮培养状态下细胞密度足够大时进行，生长面或悬浮培养状态下细胞密度足够大时进行， 原代细胞一经传代即改称为原代细胞一经传代即改称为细胞系细胞系，细胞系可以，细胞系可以 继续传代。细胞传代期是个整个培养过程的主要继续传代。细胞传代期是个整个培养过程的主要 时期，持续时间最长。时期，持续时间最长。 特点：特点： 细胞分裂增殖活动旺盛，细胞生长活跃。细胞分裂增殖活动旺盛，细胞生长活跃。 在传代期内，细胞逐渐进入在传代期内，细胞逐渐进入去分化去分化状态。状态。 原本混杂的细胞，会以一种能力强的细胞逐渐原本混杂的细胞，会

34、以一种能力强的细胞逐渐 处于优势，比例越来越大。处于优势，比例越来越大。 在传代培养期的早期，细胞尚能保持二倍体核在传代培养期的早期，细胞尚能保持二倍体核 型，随着传代次数的增多，细胞发生转化的概型，随着传代次数的增多，细胞发生转化的概 率增大。率增大。 (三三) 衰退期衰退期 正常二倍体细胞传代到一定的代数时，细胞的生命正常二倍体细胞传代到一定的代数时，细胞的生命 活动明显减弱，细胞虽然生存，但增殖缓慢或不再增殖活动明显减弱，细胞虽然生存，但增殖缓慢或不再增殖 ，培养物很难长满培养空间，即便是及时更换新营养液，培养物很难长满培养空间，即便是及时更换新营养液 也无济于事。也无济于事。 此期细胞

35、轮廓增强，胞质出现颗粒、空泡和脂滴等此期细胞轮廓增强，胞质出现颗粒、空泡和脂滴等 ，最终细胞发生程序化死亡，最终细胞发生程序化死亡(PCD或或Apoptosis)。 镜下特点：镜下特点： 镜下观察可见细胞轮廓增强，透明度低，镜下观察可见细胞轮廓增强，透明度低， 细胞浆内出现暗的颗粒样结构以及空泡状结细胞浆内出现暗的颗粒样结构以及空泡状结 构。胞质突起回缩，突起边缘有时脱落。构。胞质突起回缩，突起边缘有时脱落。 处于衰退期的细胞以任何方法都不能阻处于衰退期的细胞以任何方法都不能阻 止其向死亡发展。止其向死亡发展。 细胞转化细胞转化：可发生三期中任何一点，多发生在传代期或衰可发生三期中任何一点，多

36、发生在传代期或衰 退期，细胞发生转化的标志：退期，细胞发生转化的标志： 获得永生性获得永生性(也称不死性也称不死性)或恶性性或恶性性 即细胞获得持久增殖能力，称无限细胞系即细胞获得持久增殖能力，称无限细胞系(Infinite cell line)或连续细胞系或连续细胞系(Continuous cell line)。 细胞核型改变细胞核型改变 由二倍体变成异倍体由二倍体变成异倍体(Heteroploid) 正常细胞在培养条件较好情况下，细胞增殖旺正常细胞在培养条件较好情况下，细胞增殖旺 盛，并能维持二倍体核型，这种细胞称盛，并能维持二倍体核型，这种细胞称二倍体细二倍体细 胞系胞系(Diploid

37、 cell line)。为保持二倍体核型，细胞为保持二倍体核型，细胞 应在传代后早期冻存应在传代后早期冻存(10代内代内)若不冻存，需反若不冻存，需反 复传代，但可能细胞失去二倍体性质或发生转化复传代，但可能细胞失去二倍体性质或发生转化 3050代，细胞增殖缓慢，最终完全停止。代，细胞增殖缓慢，最终完全停止。 二二. 组织细胞培养一代的生长过程组织细胞培养一代的生长过程 传代的频率或间隔与下列因素有关：细胞性质传代的频率或间隔与下列因素有关：细胞性质 (diploid cell line，Infinite cell line)、培养液性质、培养液性质(Serum多多 少少)、接种的细胞数量和细

38、胞增殖速度等。、接种的细胞数量和细胞增殖速度等。 细胞细胞“一代一代”系指从细胞接种到分离再培养时的一段系指从细胞接种到分离再培养时的一段 时间时间，是细胞培养工作中的一种习惯说法，与细胞倍增一，是细胞培养工作中的一种习惯说法，与细胞倍增一 代的含义不同。代的含义不同。 在细胞一代中，细胞能倍增在细胞一代中，细胞能倍增36次。次。 细胞传一代后，通常经历三个阶段：细胞传一代后，通常经历三个阶段： 1.潜伏期潜伏期(latent phage)：是细胞对传代操作所致损伤是细胞对传代操作所致损伤 的恢复期以及对新的生长环境的适应期。不论从活体组织的恢复期以及对新的生长环境的适应期。不论从活体组织 制

39、备细胞悬液进行原代培养，还是在进行传代操作时，都制备细胞悬液进行原代培养，还是在进行传代操作时，都 要使用蛋白酶等消化酶处理，细胞之间以及细胞及支持物要使用蛋白酶等消化酶处理，细胞之间以及细胞及支持物 黏附与连接的分子被破坏，细胞受到损伤。接种到培养器黏附与连接的分子被破坏，细胞受到损伤。接种到培养器 皿后，先经过一个皿后，先经过一个短暂的悬浮期短暂的悬浮期，接着细胞贴附在支持物，接着细胞贴附在支持物 上，称贴壁，悬浮期结束。该期细胞修复损伤，上，称贴壁，悬浮期结束。该期细胞修复损伤，“熟悉熟悉” 环境，恢复生长，但很少分裂。环境，恢复生长，但很少分裂。 悬浮期悬浮期：细胞质回缩，胞体呈圆球形

40、。：细胞质回缩，胞体呈圆球形。 贴壁贴壁 各种细胞贴附速度不同各种细胞贴附速度不同 细胞种类和性质细胞种类和性质(原代细胞慢原代细胞慢) 培养基成分培养基成分(血清中纤维连接素血清中纤维连接素) 底物的理化性质底物的理化性质(是否清洁，电荷性质是否清洁，电荷性质) 极性细胞极性细胞 潜伏期由细胞种类、细胞接种密度和培养基潜伏期由细胞种类、细胞接种密度和培养基 性质等决定。性质等决定。 该期细胞可有运动活动，少见分裂相，基本该期细胞可有运动活动，少见分裂相，基本 不增殖。不增殖。当出现细胞分裂相并开始增多时，标志当出现细胞分裂相并开始增多时，标志 细胞已进入指数增生期细胞已进入指数增生期。 2.

41、 指数增生期：指数增生期：是细胞增殖最活跃，细胞活力是细胞增殖最活跃，细胞活力 最旺盛的阶段，分裂相增多，培养物中的细胞数量呈指最旺盛的阶段，分裂相增多，培养物中的细胞数量呈指 数增长。指数生长期内细胞分裂相数量（即细胞增殖活数增长。指数生长期内细胞分裂相数量（即细胞增殖活 性）可以作为判断细胞生长是否旺盛的重要标志。性）可以作为判断细胞生长是否旺盛的重要标志。 一般以一般以细胞细胞分裂指数分裂指数(Mitotic Index，MI)和和细胞群细胞群 体倍增时间体倍增时间表示。表示。 MI即细胞群中每即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。个细胞中的分裂相数。 细胞群体倍增时间细胞群体倍增时间

42、是指培养物中细胞数量翻倍的平是指培养物中细胞数量翻倍的平 均时间。均时间。 能够间接反映细胞活力和增殖活动强弱的能够间接反映细胞活力和增殖活动强弱的 MTT法以及用标记核苷酸掺入量反映法以及用标记核苷酸掺入量反映DNA合成合成 快慢的方法等都可以用来检测细胞的增殖活性。快慢的方法等都可以用来检测细胞的增殖活性。 体外培养细胞的增殖活性与细胞种类、供体体外培养细胞的增殖活性与细胞种类、供体 年龄以及培养条件年龄以及培养条件(培养液成分、培养液成分、pH、培养温度、培养温度 等等)等多种因素密切相关。一般细胞的等多种因素密切相关。一般细胞的MI约为约为 0.1%0.5%；原代培养物的；原代培养物的

43、MI比传代培养物的比传代培养物的 MI低；连续细胞系和肿瘤细胞的低；连续细胞系和肿瘤细胞的MI较高，可达较高，可达 3%5%(肿瘤细胞偏高肿瘤细胞偏高)。 指数增生期是细胞一代中活力最好和最主要指数增生期是细胞一代中活力最好和最主要 的时期，各种试验多在此期进行。的时期，各种试验多在此期进行。 在接种的细胞数量适宜、培养条件合适的情在接种的细胞数量适宜、培养条件合适的情 况下，指数生长期一般持续况下，指数生长期一般持续35天，随细胞天，随细胞 数量不断增多、生长空间渐趋减少，最后细数量不断增多、生长空间渐趋减少，最后细 胞相互接触汇合成片，长满培养器皿。胞相互接触汇合成片，长满培养器皿。 正常

44、细胞正常细胞指数增生期持续指数增生期持续35天，细胞相互接触能抑天，细胞相互接触能抑 制细胞进一步的运动，这种现象称为制细胞进一步的运动，这种现象称为接触抑制接触抑制(Contact inhibition)，彼此连接成片，生长面积消失。而，彼此连接成片，生长面积消失。而恶性细胞无恶性细胞无 接触抑制现象接触抑制现象，可继续移动和增殖，细胞向三维空间运动，可继续移动和增殖，细胞向三维空间运动， 发生细胞堆积发生细胞堆积(piled up)，因此，因此接接触抑制可作为区别正常细触抑制可作为区别正常细 胞和癌细胞的标志之一胞和癌细胞的标志之一。 细胞发生接触抑制后，只要营养充分，仍能进行增殖细胞发生

45、接触抑制后，只要营养充分，仍能进行增殖 分裂，但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，分裂，但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少， 代谢产物增多时，因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生代谢产物增多时，因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生 密度抑制密度抑制(Density inhibition)，导致细胞分裂停止。，导致细胞分裂停止。 注意：接触抑制与密度抑制的区别注意：接触抑制与密度抑制的区别 3. 停滞期：停滞期：又称平顶期，细胞数量达到饱和又称平顶期，细胞数量达到饱和 密度后，不再分裂增殖，进入停滞期。细胞数量密度后，不再分裂增殖，进入停滞期。细胞数量 维持在某一水平上，生长活动

46、停滞，但仍有代谢维持在某一水平上，生长活动停滞，但仍有代谢 活动，该期培养液中营养物质渐趋枯竭，代谢产活动，该期培养液中营养物质渐趋枯竭，代谢产 物积累，物积累，pH。应及时传代，否则细胞发生中毒，。应及时传代，否则细胞发生中毒， 形态老化，重者脱落死亡。传代应越早越好。形态老化，重者脱落死亡。传代应越早越好。注注 意！意！ 体外培养细胞一代增殖生长过程体外培养细胞一代增殖生长过程 细细 胞胞 增增 长长 数数 潜伏期潜伏期 指数增生期指数增生期 细胞数增大细胞数增大 极限点极限点 细胞增殖率细胞增殖率 极限点极限点 平项期平项期 退化死亡退化死亡 24h 48h 72h 96h 120h 三

47、三. 培养细胞的遗传学特征培养细胞的遗传学特征 培养细胞是细胞遗传学研究的重要工具，体培养细胞是细胞遗传学研究的重要工具，体 内细胞的遗传学特征比较稳定，但细胞离体培养内细胞的遗传学特征比较稳定，但细胞离体培养 后，很易发生细胞遗传学变化。细胞遗传学特征后，很易发生细胞遗传学变化。细胞遗传学特征 是检测培养细胞的一项极重要的指标。是检测培养细胞的一项极重要的指标。 1. 核型变化：核型变化：分裂中期染色体呈标准形态是研究染分裂中期染色体呈标准形态是研究染 色体形态最好的阶段。色体形态最好的阶段。 二倍体细胞二倍体细胞：在细胞培养中呈二倍体核型的细胞群体：在细胞培养中呈二倍体核型的细胞群体 称称

48、Diploid Cells。 二倍体细胞培养：能维持培养细胞保持二倍体核型的二倍体细胞培养：能维持培养细胞保持二倍体核型的 培养方法。培养方法。 初代正常培养细胞多呈二倍体，通过传代成细胞系后，初代正常培养细胞多呈二倍体，通过传代成细胞系后， 在培养条件良好情况下，可长期保持二倍体状态，为在培养条件良好情况下，可长期保持二倍体状态，为二倍二倍 体细胞系体细胞系(Diploid Cell line)。 长期传代后，会发生偏离二倍体现象，但只要二倍体长期传代后，会发生偏离二倍体现象，但只要二倍体 核型细胞数在这一群体中仍具优势核型细胞数在这一群体中仍具优势(75%以上以上)，仍可视为，仍可视为 二

49、倍体细胞系。二倍体细胞系。 肿瘤细胞或细胞发生转化、恶变后，失去二倍体核型，肿瘤细胞或细胞发生转化、恶变后，失去二倍体核型， 成为多倍体成为多倍体(polyploid)和异倍体细胞和异倍体细胞(Heteroploid)或其他形或其他形 式的变化。异倍体居多。式的变化。异倍体居多。 培养细胞经常发生异倍化，是细胞随环境的变化呈现培养细胞经常发生异倍化，是细胞随环境的变化呈现 自然选择和淘汰的过程，导致在细胞中可存在几个不同核自然选择和淘汰的过程，导致在细胞中可存在几个不同核 型的细胞系。当某一核型的细胞在该细胞群中居多数时，型的细胞系。当某一核型的细胞在该细胞群中居多数时， 此细胞群即称为干系此

50、细胞群即称为干系(Stem Line)。 对长期使用的细胞或新引进的细胞，应做定期核型检对长期使用的细胞或新引进的细胞，应做定期核型检 查，以掌握细胞的遗传动向。查，以掌握细胞的遗传动向。 2. 永生化和恶变永生化和恶变(immortalization and malignancy)： 前者也称不死性，是细胞获得体外持续生长增殖能力的前者也称不死性，是细胞获得体外持续生长增殖能力的 特性，可恶变；后者指细胞不仅能无限增殖生长，而且具特性，可恶变；后者指细胞不仅能无限增殖生长，而且具 有异体接种致瘤性。与有异体接种致瘤性。与Diploid Cell区别：区别： （1）非二倍体核型）非二倍体核型

51、（2）无限增殖生长性）无限增殖生长性 两者是细胞两种不同的性状。两者是细胞两种不同的性状。 四四.细胞和细胞、细胞和基质的相互关系细胞和细胞、细胞和基质的相互关系 1.群体依赖性群体依赖性(PD，Population Dependence) 单个细胞不是细胞永久存在的形式，不能长期生存。一个单个细胞不是细胞永久存在的形式，不能长期生存。一个 有活力的细胞终需经过繁殖形成群体，只有群体细胞才是培养有活力的细胞终需经过繁殖形成群体，只有群体细胞才是培养 细胞的基本存在形式。单个细胞虽能生长繁殖，但不如群体细细胞的基本存在形式。单个细胞虽能生长繁殖，但不如群体细 胞生存能力强，细胞量多时比少时易于培

52、养，说明细胞之间能胞生存能力强，细胞量多时比少时易于培养，说明细胞之间能 相互沟通信息，呈现着相互依存性或群体依赖性。相互沟通信息，呈现着相互依存性或群体依赖性。 正常细胞群正常细胞群PD比转化细胞大，转化细胞和恶性细胞比转化细胞大，转化细胞和恶性细胞PD小，小， 即即PD与细胞恶性成反比关系，恶性细胞独立生存能力增大。与细胞恶性成反比关系，恶性细胞独立生存能力增大。 2.细胞外基质对细胞贴附、分化、生长和增殖都有重要作用细胞外基质对细胞贴附、分化、生长和增殖都有重要作用 第第4节节 影响培养细胞成功的因素影响培养细胞成功的因素 如何提高细胞在体外培养的成功率，是细胞培养如何提高细胞在体外培养

53、的成功率，是细胞培养 实验工作的首要问题。实验工作的首要问题。关键在于原代培养关键在于原代培养。 贴附型细胞贴附型细胞培养成功条件：培养成功条件： (1)培养物培养物(细胞或组织块细胞或组织块)必须贴壁，继而发生运动、必须贴壁，继而发生运动、 生长增殖和细胞数量增多，标志着成功率达生长增殖和细胞数量增多，标志着成功率达90%或已或已 基本成功。基本成功。 (2)扩大再培养，使细胞数量增多和继续生存。扩大再培养，使细胞数量增多和继续生存。 悬浮型细胞悬浮型细胞培养成功的标志：细胞增殖。培养成功的标志：细胞增殖。 影响培养成功的因素：影响培养成功的因素： 一、供体年龄一、供体年龄 1.成活率，胚胎

54、成活率，胚胎幼年幼年成年。成年。 2.同一个体的组织，分化低的组织细胞同一个体的组织，分化低的组织细胞高分化的高分化的 组织细胞。组织细胞。 3.组织细胞的异质性，个别细胞优势生长组织细胞的异质性，个别细胞优势生长 4.干细胞干细胞非干细胞。非干细胞。 二、培养条件二、培养条件 1不同细胞对培养基需求不同，应选择相不同细胞对培养基需求不同，应选择相 应的培养基，尤其是正常细胞。应的培养基，尤其是正常细胞。 2无限细胞系和肿瘤细胞系适应性强，可无限细胞系和肿瘤细胞系适应性强，可 在各种培养基中生存。在各种培养基中生存。 三、贴附底物三、贴附底物 1贴附细胞：贴附是细胞增殖生长的条件，贴附细胞：贴

55、附是细胞增殖生长的条件， 只有细胞只有细胞 贴附到底物上才能生长增殖，贴附到底物上才能生长增殖， 初代培养尤为重要初代培养尤为重要。不同。不同 细胞对附着底物要求不同。细胞对附着底物要求不同。 2 一旦成为细胞系后，多能顺利贴壁。一旦成为细胞系后，多能顺利贴壁。 特殊细胞培养，如：特殊细胞培养，如： 神经元神经元鼠尾胶原处理，鼠尾胶原处理， 乳腺上皮、大肠上皮细胞乳腺上皮、大肠上皮细胞饲细胞饲细胞 四、培养方法四、培养方法(酶的应用酶的应用) 不同消化分散组织的方法对细胞的贴壁和生长增不同消化分散组织的方法对细胞的贴壁和生长增 殖有影响，胶原纤维多的组织用胶原酶消化，上皮细胞殖有影响，胶原纤维

56、多的组织用胶原酶消化，上皮细胞 适用胰蛋白酶消化。选择适宜消化法和培养法是培养成适用胰蛋白酶消化。选择适宜消化法和培养法是培养成 功不可忽视的条件。功不可忽视的条件。 综合上述诸多因素，制定最佳方案，方能获得成功综合上述诸多因素，制定最佳方案，方能获得成功 (初代培养初代培养)。 第第4节节 建立细胞系或细胞株建立细胞系或细胞株 各种已被命名各种已被命名Cell line和经过细胞生物学和经过细胞生物学 鉴定鉴定Cell Strain具有以下特征：具有以下特征： 形态均一形态均一 生长增殖稳定生长增殖稳定 生物学性状清楚生物学性状清楚 即即已鉴定的细胞已鉴定的细胞(Certified Cell

57、s)。 可用于各种实验研究和生产生物制品。可用于各种实验研究和生产生物制品。 一、一、 体外培养细胞的种类和命名体外培养细胞的种类和命名 （一）原代培养（一）原代培养(初代培养，初代培养，Primary culture) 直接从活体取出组织、细胞和器官进行第一次培养直接从活体取出组织、细胞和器官进行第一次培养 的培养物。的培养物。 （二）细胞系（二）细胞系(Cell line) 原代培养细胞一经传代即成为原代培养细胞一经传代即成为Cell line. 由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同 的细胞系，称该细胞系的亚系的细胞系，称该细胞系的亚

58、系(Subsrain)。 有限细胞系有限细胞系(finite cell line)：细胞生存期有限，：细胞生存期有限， 如如Diploid Cell line. 无限细胞系无限细胞系(infinite cell line)或连续细胞系：获得无限或连续细胞系：获得无限 增殖能力，可持续生存增殖能力，可持续生存,本质为已发生转化的细胞本质为已发生转化的细胞 异倍体核型异倍体核型 永生性：仍保留接触抑制，无异体接种永生性：仍保留接触抑制，无异体接种 致瘤性致瘤性 恶性性质：永生性和致瘤性恶性性质：永生性和致瘤性 (三三)细胞克隆细胞克隆 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通 过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞克隆。过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞克隆。 (四四) 二倍体细胞二倍体细胞(Diploid Cell) 为有限细胞系，根据供体年龄和细胞不同，寿命长短各为有限细