分子生物学课件：第三章 蛋白质相互作用

1、第三章第三章 蛋白质相互作用蛋白质相互作用 n蛋白质相互作用（蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）是指两个或两个以）是指两个或两个以 上的蛋白质分子通过上的蛋白质分子通过非共价键非共价键形成蛋白形成蛋白 质复合体（质复合体（ protein complex）的过程）的过程 n分子机器分子机器 n蛋白质复合体是生命分子机器的核心结构蛋白质复合体是生命分子机器的核心结构 n蛋白质复合体的形式蛋白质复合体的形式 二聚体dimer 三聚体trimer 寡聚体oligomer 多聚体polymer 同聚体homopolymer 异聚体heteropolymer

2、 n复合体的形状复合体的形状 n复合体的稳定性复合体的稳定性 n细胞内环境有利用蛋白质复合体的形成 n体外PPI研究难以模拟细胞内环境 蛋白质网络（interactome） PPI的结构基础 PPI 界面依靠非共价键维系 n氢键氢键 n范德华力范德华力 n疏水力疏水力 n离子键离子键 n共价键共价键 nPPI 界面大小影响稳定性 蛋白质相互作用结构域 n结构域是蛋白质中折叠较为紧密且具有是蛋白质中折叠较为紧密且具有 一定功能的球状和纤维状的结构，以模一定功能的球状和纤维状的结构，以模 块方式具有多种不同功能的分子。块方式具有多种不同功能的分子。 n蛋白质相互作用结构域专指那些可以识专指那些可以

3、识 别其他蛋白质的特殊结构，从而介导两别其他蛋白质的特殊结构，从而介导两 个蛋白之间发生相互作用的结构域，一个蛋白之间发生相互作用的结构域，一 般由般由50-100个氨基酸组成。个氨基酸组成。 n结构域结构域相互作用结构域结构域相互作用 n结构域结构域-肽段模体相互作用肽段模体相互作用 SH2结构域 n约100个氨基酸序列，识别磷酸化的酪氨 酸及相邻的3-6个氨基酸残基。 SH3结构域 n由50个氨基酸残基组成，存在于各种蛋 白激酶和衔接蛋白中，识别富含脯氨酸 的序列R/KXXPXXP或PXXPXR/K，其亲和力 与脯氨酸残基及相邻氨基酸残基组成相 关。 PH结构域 n100-120个氨基酸残

4、基组成，存在于多种 细胞骨架蛋白，蛋白激酶、PLC超家族中。 n兼具结合脂类和蛋白质的能力，参与细 胞信号转导。 WW结构域 n30-40个氨基酸残基组成的三股反平行 片层结构域，含两个高度保守的色氨酸 WW而得名，识别富含脯氨酸的序列XPPXY， 参与非受体信号转导、转录调节和蛋白 质降解等过程。 PDZ结构域 n由80-100个氨基酸残基组成，包含2个 -螺旋和6个-折叠，常以串联重复拷 贝存在，是构成支架蛋白的重要结构， 在细胞膜蛋白质的聚集中发挥重要作用。 蛋白质相互作用结构域识别蛋白 质的翻译后修饰 nSH2结构域识别含磷酸化酪氨酸模体结构域识别含磷酸化酪氨酸模体 nFHA结构域和结

5、构域和MH2结构域识别含磷酸化结构域识别含磷酸化 丝氨酸丝氨酸/苏氨酸模体苏氨酸模体 nBromo结构域识别组蛋白中的乙酰化赖结构域识别组蛋白中的乙酰化赖 氨酸氨酸 nChromo结构域识别组蛋白中的甲基化结构域识别组蛋白中的甲基化 赖氨酸赖氨酸 衔接蛋白和支架蛋白是蛋白质复合体衔接蛋白和支架蛋白是蛋白质复合体 的接头和骨架的接头和骨架 nAdaptor protein nGRB2(growth factor receptor-binding protein2) SH3-SH2-SH3 nNCK(noncatalytic region of tyrosine kinase) SH3-SH3-S

6、H3-SH2 nScaffold protein nJIP-1(JNK-interacting protein1) PPI 研究的医学意义 nPPIPPI异常可导致细胞活动失控异常可导致细胞活动失控 n相互作用能力的丧失可丧失原有的正常调节。相互作用能力的丧失可丧失原有的正常调节。 n突变也可产生新的相互作用。突变也可产生新的相互作用。 n抑制抑制PPIPPI n设计小分子和多肽抑制剂，特异性结合于设计小分子和多肽抑制剂，特异性结合于PPIPPI的界面，的界面， 阻断阻断PPIPPI。马拉维诺马拉维诺 赫赛汀赫赛汀 n增强增强PPI PPI P53 MDM2P53 MDM2 PPI 研究策略

7、n蛋白质复合物空间结构的精细解析蛋白质复合物空间结构的精细解析 n X射线晶体衍射射线晶体衍射 n核磁共振波谱核磁共振波谱 n三维电镜重构技术三维电镜重构技术 nPPI的高通量研究的高通量研究 n酵母双杂交酵母双杂交 n亲和纯化联合质谱技术亲和纯化联合质谱技术 蛋白质相互作用的类型蛋白质相互作用的类型 n蛋白质相互作用的类型：蛋白质相互作用的类型：牢固型牢固型互作和互作和暂时型暂时型互作两互作两 种。互作力既可以强，也可以弱。种。互作力既可以强，也可以弱。 n牢固型互作：以多亚基蛋白复合体常见，可以通过牢固型互作：以多亚基蛋白复合体常见，可以通过免免 疫共沉淀、疫共沉淀、Pull-down法法

8、研究。研究。 n暂时型互作：涉及到胞内大部分生物过程，包括蛋白暂时型互作：涉及到胞内大部分生物过程，包括蛋白 折叠、修饰、转运、信号转导和细胞周期等。折叠、修饰、转运、信号转导和细胞周期等。 研究技术研究技术 n酵母双杂交筛选系统酵母双杂交筛选系统 n蛋白质亲和色谱蛋白质亲和色谱 nPull-down Pull-down 技术技术 n免疫共沉淀免疫共沉淀 n细胞免疫荧光染色细胞免疫荧光染色 n荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（FRETFRET） n表面等离子共振表面等离子共振 ( (一一) ) 酵母双杂交技术酵母双杂交技术 n一种基因筛选策略：蛋白质之间微弱的、瞬间的一种基因筛选策略：蛋白质

9、之间微弱的、瞬间的 作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测 得到得到 。 n酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告基因报告基因 的表达探测蛋白蛋白的相互作用。的表达探测蛋白蛋白的相互作用。 n用于活细胞体内的蛋白质之间的相互作用研究。用于活细胞体内的蛋白质之间的相互作用研究。 n简便、快速地分离到新的互作蛋白。简便、快速地分离到新的互作蛋白。 原原 理理 n原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转 录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。录因子通常需要两个或以上

10、相互独立的结构域组成。 分别使结合域和激活域同分别使结合域和激活域同诱饵蛋白诱饵蛋白和和猎物蛋白猎物蛋白形成形成 融合蛋白，在酵母细胞中表达，如果两种蛋白可以融合蛋白，在酵母细胞中表达，如果两种蛋白可以 发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充 分接近，从而激活报告基因。分接近，从而激活报告基因。 n酵母的转录因子酵母的转录因子GAL4 GAL4由功能上由功能上相互独立的结相互独立的结 构域构域构成，构成，DNA结合结合功能域功能域(DNA binding domain， DBD)和和转录激活结构域转录激活结构域（activation domai

11、n， AD）。只有当被分开的两者通过适当的途径在空间）。只有当被分开的两者通过适当的途径在空间 上较为接近时，才能重新呈现完整的上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子转录因子 活性，使启动子下游基因得到转录。活性，使启动子下游基因得到转录。 酵母双杂交酵母双杂交 优优 点点 1. 作用信号是在融合基因表达后，作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因在细胞内重建转录因 子的作用而给出的，子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 2. 检测在活细胞内进行，检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内可以在一定程度上代表细胞内 的真实情况。的

12、真实情况。 3. 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可因而可 检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。 4. 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和 分化时期材料构建分化时期材料构建cDNA文库，文库， 能分析细胞浆、细胞能分析细胞浆、细胞 核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。 缺点缺点 n 自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合 蛋白会影响

13、蛋白的真实结构和功能。不利于核蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核 外蛋白研究，会导致假阴性外蛋白研究，会导致假阴性 。 n利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 n在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 n利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋 白质之间相互作用的影响白质之间相互作用的影响 n利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图 （Genome Protein Linkage Map） 应应 用用 n2005年年9月月1日出版的

14、电子版日出版的电子版Cell上，德国上，德国 科学家采用了科学家采用了4456个诱饵蛋白和个诱饵蛋白和5632个个 猎物蛋白，采用猎物蛋白，采用 酵母酵母双杂交方法进行研究。双杂交方法进行研究。 结果，在结果，在1705种蛋白质间之间确定了种蛋白质间之间确定了 3186种新的相互作用关系。同时采用免疫种新的相互作用关系。同时采用免疫 共沉淀和共沉淀和Pull-down验证了这一结果。再验证了这一结果。再 通过拓扑学等评价，至少在通过拓扑学等评价，至少在401种蛋白质种蛋白质 间有间有911种相互作用联系。种相互作用联系。 蛋白质亲和色谱蛋白质亲和色谱 n 基本原理是将一种蛋白质固定于某种基 质

15、上（如Sepharose），当细胞抽提液经 过改基质时，可与该固定蛋白相互作用 的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目 标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白 可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回 收下来。 应用应用 n被用于蛋白质复合体的大规模筛选被用于蛋白质复合体的大规模筛选 n与化学交联法联合可以提高筛选效率与化学交联法联合可以提高筛选效率 n与酵母双杂交联合为探讨与酵母双杂交联合为探讨PPI的动态特性提供的动态特性提供 有意义的信息有意义的信息 Pull-Down技术技术 n 目的：目的： 1. 用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白（生物素用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白（生物素- 、 Po

16、lyHis-或或GST-），从细胞裂解液中钓出与之互作的），从细胞裂解液中钓出与之互作的 蛋白。蛋白。 2. 确定已知的饵蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间确定已知的饵蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间 的相互作用关系。的相互作用关系。 3. 从体外转录或翻译体系中检测出蛋白相互作用。从体外转录或翻译体系中检测出蛋白相互作用。 优优 点点 1. 用普通的试验仪器和试剂（如离心机、用普通的试验仪器和试剂（如离心机、 Mini-Gel、蛋白染色）、蛋白染色） 2. 灵活的灵活的Pull-Down模式，盐离子、变性剂浓模式，盐离子、变性剂浓 度可调，对于弱蛋白相互作用也适用。度可调，对于弱蛋白相互作

17、用也适用。 3. 一天之内一天之内“Pull Down”和检测可能与饵蛋白和检测可能与饵蛋白 相结合的蛋白。相结合的蛋白。 4. 高效回收互作蛋白复合物。高效回收互作蛋白复合物。 缺点缺点 n表位附加标记可能会使融合蛋白不稳定，改变表位附加标记可能会使融合蛋白不稳定，改变 或或使融合蛋白功能丧失使融合蛋白功能丧失。 n 出现假阳性出现假阳性。实验所检测到的相互作用可能。实验所检测到的相互作用可能 时由蛋白质所带电荷引起的，并不是生理性的时由蛋白质所带电荷引起的，并不是生理性的 相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的， 可是由第三者作为中介的；有时会检

18、测到两种可是由第三者作为中介的；有时会检测到两种 在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。 因此实验结果还应经其他方法验证因此实验结果还应经其他方法验证。 免疫共沉淀 （co-immunoprecipitation） n免疫共沉淀（免疫共沉淀（co-IP）是以抗体和抗原之间的是以抗体和抗原之间的 特异性结合为基础，确定两种蛋白质在完整的特异性结合为基础，确定两种蛋白质在完整的 细胞内生理性相互作用的有效方法。细胞内生理性相互作用的有效方法。 n优点优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可 以在天然状态下进行，可以避免认

19、为影响；可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可 以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合 体。体。 n缺点：缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复 合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵 敏度不如亲和色谱高。敏度不如亲和色谱高。 Co-Immunoprecipitation (Western Blot or MS) HBc-YFP pEYFP FLAG-MxA WT FLAG-MxA L612K FLAG-MxA K83A Anti-GFP-IP IP IP 4% input

20、4% input FLAG-MxA FLAG-MxA HBc-YFP HBc-YFP YFP 细胞免疫荧光染色细胞免疫荧光染色 n利用不同荧光基团标记的抗体与细胞内相应蛋利用不同荧光基团标记的抗体与细胞内相应蛋 白的结合，借助激光共聚焦显微镜获取荧光图白的结合，借助激光共聚焦显微镜获取荧光图 像，若不同的蛋白的荧光图像有像，若不同的蛋白的荧光图像有共定位共定位（co-co- localizationlocalization），则可提供这些蛋白有相互作），则可提供这些蛋白有相互作 用的可能性。用的可能性。 n共定位不一定有相互作用，可能是间接相互作共定位不一定有相互作用，可能是间接相互作 用用。

21、 MxA colocalizes with HBcAg A CFP-MxAHBcAgMerged HBcAgCFP-K83A HBcAgCFP-L612K Merged Merged Li N et al. Hepatology. 2012 B YFP-HBcAgMergedCFP-MxA YFP-HBcAgMergedCFP-K83A CFP-L612KYFP-HBcAgMerged 荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术 (Fluorescence resonance energy transfer) FRET 原理：原理： 两种荧光蛋白两种荧光蛋白CFP和和 YFP，CFP的的发射光谱

22、发射光谱与与 YFP的的吸收光谱吸收光谱有相当的重叠有相当的重叠, 当它们足够接近当它们足够接近 时时, 用用CFP的吸收波长激发的吸收波长激发, CFP的发色基团将会的发色基团将会 把能量高效率地共振转移至把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上的发色基团上, 所以所以CFP的发射荧光将减弱或消失的发射荧光将减弱或消失, 主要发射将主要发射将 是是YFP的荧光。两个发色基团之间的能量的荧光。两个发色基团之间的能量转换效转换效 率率与它们之间的与它们之间的空间距离的空间距离的6次方成反比次方成反比, 对空间对空间 位置的改变非常灵敏。位置的改变非常灵敏。 The donor emission

23、 spectrum must significantly overlap the excitation spectrum of the acceptor 供体发射波与受体供体发射波与受体 激发波有重叠激发波有重叠 The donor and acceptor fluorophores must be in favorable mutual orientation 合适的空间取向合适的空间取向 The distance between the donor and acceptor fluorophores must be less than 100 距离距离100 FRET: basic req

24、uirements Detecting methods Monitor changes in donor fluorescence 检测供体检测供体 荧光荧光 Monitor changes in acceptor fluorescence 检测受检测受 体荧光体荧光 Simultaneously measure changes in both donor and acceptor fluorescence using spectral imaging 同时检测受体和供体荧光同时检测受体和供体荧光 100 Ex=452 nm Em=527 nm Em=475 nm 荧光共振能量转移荧光共振能量

25、转移(FRET)技术验证蛋技术验证蛋 白质之间的相互作用白质之间的相互作用 Transfer Excitation Emission 要研究两种蛋白质要研究两种蛋白质a和和b间的相互作用间的相互作用,可以根据可以根据FRET 原理构建一融合蛋白，这种融合蛋白由三部分组成原理构建一融合蛋白，这种融合蛋白由三部分组成: CFP, 蛋白质蛋白质b， YFP。 用用CFP吸收波长吸收波长452 nm作为激发波长作为激发波长, 当蛋白质当蛋白质a与与b没有发生相互作用时没有发生相互作用时, CFP与与YFP相距很远相距很远 不能发生荧光共振能量转移不能发生荧光共振能量转移,因而检测到的是发射波长因而检测

26、到的是发射波长 476 nm的的CFP荧光荧光;但当蛋白质但当蛋白质a与与b发生相互作用时发生相互作用时,由由 于蛋白质于蛋白质b受蛋白质受蛋白质a作用而发生构象变化作用而发生构象变化,使使CFP与与YFP 充分靠近发生荧光共振能量转移，此时检测到的就是发充分靠近发生荧光共振能量转移，此时检测到的就是发 射波长为射波长为527 nm的的YFP荧光。将编码这种融合蛋白的基荧光。将编码这种融合蛋白的基 因通过转基因技术使其在细胞内表达，这样就可以在活细因通过转基因技术使其在细胞内表达，这样就可以在活细 胞生理条件下研究蛋白质胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间的相互作用。蛋白质间的相互作用。 Phot

27、obleaching Photobleaching: an example 应用实例应用实例 1、关于细胞凋亡的研究、关于细胞凋亡的研究 Reiko等利用等利用FRET技术研究了技术研究了Caspase8与与Bid蛋白之间的相互作用蛋白之间的相互作用, 研究者将研究者将Bid蛋白两端分别与蛋白两端分别与CFP与与YFP融合，精心设计使其在没有被融合，精心设计使其在没有被 裂解前刚好可以发生裂解前刚好可以发生FRET ，当，当Bid蛋白被裂解后蛋白被裂解后FRET效应自然消效应自然消 失，这是一种很好的检测失，这是一种很好的检测Caspase8 酶活性方法，而且当酶活性方法，而且当Bid蛋白与蛋

28、白与 CFP与与YFP融合之后仍能行使正常的功能，当融合物在细胞内被裂解融合之后仍能行使正常的功能，当融合物在细胞内被裂解 后，连接后，连接CFP的片段转移到线粒体，通过的片段转移到线粒体，通过CFP荧光可以很清楚地观测荧光可以很清楚地观测 到其在细胞内的定位。到其在细胞内的定位。 2. 关于膜蛋白的研究关于膜蛋白的研究 细胞膜受体之间相互作用细胞膜受体之间相互作用: 外界外界 刺激因素向细胞内的信号传递一般认为通过其在胞膜上的刺激因素向细胞内的信号传递一般认为通过其在胞膜上的 受体受体,当配体与受体结合后当配体与受体结合后,引起受体构象变化或化学修饰，引起受体构象变化或化学修饰， 介导信号传

29、递。但是关于介导信号传递。但是关于Fas及其同源物及其同源物TNFR(均为胞膜均为胞膜 上的三聚体受体上的三聚体受体)的研究发现的研究发现,它们都可以在无配体存在的情它们都可以在无配体存在的情 况下自发组装况下自发组装,并介导信号传递并介导信号传递,引发细胞凋亡。其中在鉴定引发细胞凋亡。其中在鉴定 Fas发生三聚体化的实验中使用了发生三聚体化的实验中使用了FRET技术技术, 将将Fas分别与分别与 CFP和和YFP融合融合,利用此项技术可以很方便地观测到利用此项技术可以很方便地观测到Fas单体单体 是否发生聚合。是否发生聚合。 n优点：优点：免疫共沉淀、免疫共沉淀、pull-down等技术需要破等技术需要破 碎细胞，