Folin-酚试剂法测定蛋白质含量

1、Folin- 酚试剂法测定蛋白质含量实验目的? 掌握 Folin- 酚试剂法测定蛋白质含量的原理、操作技术? 掌握制作标准曲线的要领，并通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量。? 提高在严格时间限定下的实验操作能力。二、实验原理蛋白质分子中酪氨酸可以和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸 - 磷钼酸）起 蓝色反应，此法由 folin 在 1921 年开创。1951年， Lowry 对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应， 提高了灵敏度。第一步：双缩脲反应在碱性溶液中,双缩脲（H2N0G NH- C0NH2能与Cu2+乍用，形成紫色或紫红色的络 合物。即在碱性溶液中， 蛋白质分

2、子中的具有双缩脲结构的肽键与碱性铜试剂中的 Cu2+ 作用生成紫红色的蛋白质-Cu2+复合物。第二步： Folin- 酚显色反应Folin- 酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐 -磷钨酸盐易被酚类化合物还原 而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。蛋白质-Cu2+复合物中所含的带酚羟基的酪氨酸 或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白 质标准液比较即可求出样品中蛋白质的含量。三、实验材料（一）样品健康人血清（300倍稀释，正常人血清蛋白质含量：6080 g/L ）（二）试剂牛血清白蛋白标准液（200卩g

3、/ml）,碱性硫酸铜溶液，Folin-酚试剂（三）仪器与器材V-1100分光光度计，恒温水浴箱，移液管（2mL,洗耳球，试管6支，试管架，加 样枪，加样枪架四、实验步骤（一）操作步骤见表1-1表1-1 foli n-酚试剂法定量蛋白质实验步骤步骤操作1.反应体系取6支试管编号，按下表加入试剂，混匀空白管标准管样品管试剂（ml）123456牛血清白蛋白标准液 -0.2 0.4 0.6 0.8-样品液-0.5蒸馏水1.00.8 0.6 0.4 0.20.52.双缩脲反应向各管内分别加入碱性硫酸铜溶液 2.0ml，摇匀，室温放置10min3.foli n-酚反应向各管加入folin-酚试剂0.2ml

4、，2s内迅速摇匀。40C水浴10min后，冷却至室温4.比色测定用500ml波长比色，用1号管作空白对照，读取各管吸光度值，每管重复测三次，求平均值用于绘制标准曲线。（二）注意事项1. 操作控制：folin-酚试剂加到碱性铜-蛋白质溶液中后，必须立即混匀，使 还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸被破坏之前2. 时间控制：因反应显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。第1值试管加入2.0ml碱性硫酸铜试剂后，开始计时，1min后，第2支试管再加入 2.0ml碱性硫酸铜，以此类推。余下试剂的加入步骤和检测中，每支试管间均需严格 执行1min钟的时间间隔操作。五、实验结果与分析1. 现象与图片记录

5、操作现象双缩脲反应：各管内分别加入碱性硫酸铜溶液2.0ml，摇匀，室温放置10min后溶液呈无色透明，无明显现象folin-酚反应初：各管加入folin-25号试管溶液变黄色，颜色逐渐加深，6号试管酚试剂0.2ml，2s内迅速摇匀黄色深度介于2号和3号试管之间将各试管40C水浴10min,冷却至25号试管溶液变蓝色，颜色逐渐加深，6号试管室温蓝色深度介于2号与3号试管之间2. 数据记录 按照表1-1记录各管在500nm波长测得的吸光度值表1-2 500nm波长吸光度值记录各管吸光度值A500123456100.1270.2750.3360.4650.163200.1280.2750.3360.

6、4660.164300.1280.2760.3360.4670.165各管平均值00.1280.2750.3360.4660.164测定次数3.绘制标准曲线以A500为纵坐标，牛血清清蛋白标准液为横坐标，根据所得数据描点连线，所绘制曲线如下AE0DEFr 112351 2CCug/ml)04080120ISO30CL 1280. 2756 32G0. iGS567891F1112包14151617LIS195 4 3 2 10 o.a.o.a.a.标准曲线列吸光度）绒性阀服光厲）50100150 JOOC(ng/ml)从图中可以看出线性方程：y=0.003x,将样品溶液的吸光度（即y值）代入方

7、程,求得样品浓度为55卩g/ml4.结果计算血清蛋白浓度（卩g/ml）=样品蛋白质浓度x 2X 30055卩 g/ml x 2X 300=33000 卩 g/ml = 33g/L本次实验中所测结果为33g/L，相比较正常范围(6080 g/L ),结果明显偏低, 故认为此次实验并未成功，问题分析如下5问题分析问题解析实验所测血清蛋白浓度1.洗涤试管后未等试管晾干直接进行实验，导致试管内残偏低留的蒸馏水稀释了样品液2. 使用加样抢移取样品液时可能少量样品液残留于枪头3. Folin-酚反应时因实验室拥堵，器材使用受限，导致反应时间间隔控制不一致，样品液(在第 6支试管内)反应时间相对偏过短6.回顾与反思? Folin-酚试剂法的优缺点有哪些？优点：仪器配置要求较低，使用试剂量少，节约资源灵敏度相比双缩脲试剂法高缺点：操作步骤多，耗时长Foli n-酚试剂专一性较低，干扰物质多，稳定