化学药品灭菌无菌工艺验证指导原则培训(20150408)

1、 化学药品灭菌无菌工艺验证化学药品灭菌无菌工艺验证 指导原则指导原则 培训人：何东征培训人：何东征 部部 门：岳阳门：岳阳研发研发工艺组工艺组 2015.04. 培训内容培训内容 Click to add Title 1概述概述1 Click to add Title 2制剂湿热灭菌工艺制剂湿热灭菌工艺2 Click to add Title 1制剂无菌生产工艺制剂无菌生产工艺3 原料药无菌生产工艺的验证原料药无菌生产工艺的验证2 4 Click to add Title 1小结小结5 1. 概述概述 1.1.无菌药品是指法定药品标准中列有无菌检查项目的制剂和无菌药品是指法定药品标准中列有无菌

2、检查项目的制剂和 原料药，一般包括注射剂、无菌原料药及滴眼剂等。原料药，一般包括注射剂、无菌原料药及滴眼剂等。 1.2.“无菌无菌”：一批药品的无菌特性只能通过该批药品中活微：一批药品的无菌特性只能通过该批药品中活微 生物存在的概率低至某个可接受的水平，即无菌保证水平（生物存在的概率低至某个可接受的水平，即无菌保证水平（ Sterility Assurance Level, SAL）来表征，而这种概率意义上）来表征，而这种概率意义上 的无菌需通过合理且经过验证的灭菌工艺过程、良好的无菌保的无菌需通过合理且经过验证的灭菌工艺过程、良好的无菌保 证体系以及在生产过程中执行严格的生产质量管理规范（证

3、体系以及在生产过程中执行严格的生产质量管理规范（GMP ）予以保证。）予以保证。 1.3.无菌药品的灭菌方式通常可分为：无菌药品的灭菌方式通常可分为：1、湿热灭菌、湿热灭菌(高压饱和高压饱和 蒸汽蒸汽)；2、干热灭菌、干热灭菌（干热空气）（干热空气）；3、辐射灭菌、辐射灭菌（Y 射线）射线）； 4、气体灭菌、气体灭菌（H2O2）；5、除菌过滤、除菌过滤（0.22m滤芯）滤芯）。 1. 概述概述 1. 概述概述 1.4.按工艺的不同分为终端灭菌工艺（按工艺的不同分为终端灭菌工艺（terminal sterilizing process）和）和 无菌生产工艺（无菌生产工艺（aseptic proc

4、essing）。）。 1.4.1.终端灭菌工艺系指将完成最终密封的产品进行适当灭菌的工艺。终端灭菌工艺系指将完成最终密封的产品进行适当灭菌的工艺。 1.4.2.无菌生产工艺系指在无菌环境条件下，通过无菌操作来生产无菌药无菌生产工艺系指在无菌环境条件下，通过无菌操作来生产无菌药 品的方法品的方法 1.5.终端灭菌工艺和无菌生产工艺实现产品无菌的方法有本质上的差异，终端灭菌工艺和无菌生产工艺实现产品无菌的方法有本质上的差异， 从而决定了由这两类工艺生产的产品应该达到的最低无菌保证水平的巨大从而决定了由这两类工艺生产的产品应该达到的最低无菌保证水平的巨大 差异。最终灭菌产品的无菌保证水平为微生物污染

5、概率不超过差异。最终灭菌产品的无菌保证水平为微生物污染概率不超过10-6，对于，对于 非终端灭菌无菌产品，应通过培养基模拟灌装证明其在非终端灭菌无菌产品，应通过培养基模拟灌装证明其在95%置信限下的无置信限下的无 菌保证水平至少应小于菌保证水平至少应小于0.1%。由此可见，非终端灭菌无菌产品存在微生物。由此可见，非终端灭菌无菌产品存在微生物 污染的概率远远高于最终灭菌无菌产品，并且，在生产中影响非终端灭菌污染的概率远远高于最终灭菌无菌产品，并且，在生产中影响非终端灭菌 无菌产品的无菌保证水平的因素也相对较多，生产过程的控制难度较大，无菌产品的无菌保证水平的因素也相对较多，生产过程的控制难度较大

6、， 所以在选择无菌产品的灭菌方式时，应优选终端灭菌工艺。对于必须采用所以在选择无菌产品的灭菌方式时，应优选终端灭菌工艺。对于必须采用 非终端灭菌工艺的产品，为尽量减少产品污染微生物的风险，鼓励企业在非终端灭菌工艺的产品，为尽量减少产品污染微生物的风险，鼓励企业在 生产中采用隔离操作、吹灌封一体等先进技术。生产中采用隔离操作、吹灌封一体等先进技术。 2. 1. 湿热灭菌工艺的研究湿热灭菌工艺的研究 2.制剂湿热灭菌工艺 2.1.1.湿热灭菌工艺的确定依据湿热灭菌工艺的确定依据 2.1.2.过度杀灭法的工艺研究过度杀灭法的工艺研究 2.1.3.残存概率法的工艺研究残存概率法的工艺研究 2.2. 湿

7、热灭菌工艺的验证湿热灭菌工艺的验证 2.2.1.物理确认物理确认 2.2.2.生物学确认生物学确认 2.2.1 1 湿热灭菌工艺的研究湿热灭菌工艺的研究 2. 2. 制剂湿热灭菌工艺 2.1.1.湿热灭菌工艺的确定依据湿热灭菌工艺的确定依据 灭菌工艺的选择一般按照灭菌工艺的决策树进行，湿热灭 菌工艺是决策树中首先考虑的灭菌工艺。对于药品的灭菌工 艺的考察和确定，首先是考察其能否采用湿热灭菌工艺，能 否耐受湿热灭菌的高温。 目前湿热灭菌方法主要有两种：过度杀灭法（F012）和 残存概率法（F08）。F0值的确认应同时满足物理学确认 和生物学确认。如果F0值不能达到8，提示选择湿热灭菌工 艺不合适

8、，必须考虑其他灭菌工艺或者无菌生产工艺。 在很大程度上取决于被灭菌产品的热稳定性。药物是否能 耐受湿热灭菌工艺，除了与药物活性成分的化学性质相关外 ，还与制剂的处方、工艺、包装容器等密切相关，所以在初 期的工艺设计过程中需要通过对药物热稳定性的综合分析来 确定湿热灭菌工艺的可行性。需要注意的是，使用热不稳定 的包装材料不能作为选择无菌工艺的唯一理由。 2. 2. 制剂湿热灭菌工艺 2.1.1.1.活性成分的化学结构特点与稳定性 v通过对活性成分的化学结构进行分析，可以初步判断活性成分的稳定性。 活性成分易氧化 有针对性 的进行处 方工艺的 优化研究 v在此基础之上，还应该通过设计一系列的强制降

9、解试验对活性成分的稳定 性做进一步研究确认，了解活性成分在各种条件下可能发生的降解反应，以 便在处方工艺的研究中采取针对性的措施，保障产品能够采用湿热灭菌工艺 2.1.1.2.处方工艺的研究 采取充入惰性气体 加入适宜的抗氧化剂 活性成分的稳定 性与pH值相关 寻找最利于主成分稳 定性的pH值 主成分是因为某 些杂质的存在影 响了稳定性 适宜的手段去除相关 的杂质 2.1.1.3.稳定性研究 v无论使用何种设计方法，都需要进行最终灭菌产 品的稳定性研究。考察最终灭菌程序对产品性质稳 定性影响的指标可包括产品的降解量、含量、pH值 、颜色、缓冲能力以及产品的其它质量特性。 2. 2. 制剂湿热灭

10、菌工艺 v灭菌时，杀灭微生物的效果和活性成分的降解都 随着时间和温度而累积。这意味着加热和冷却的变 化将影响产品的稳定性，同时影响杀灭效果。因此 ，稳定性研究用样品最好选取处于最苛刻的灭菌条 件的产品，如：可采用在热穿透试验中F0最大的位 置上灭菌的产品进行稳定性考察，以确保所有灭菌 产品的质量在有效期内仍能符合要求。 2.1.2.过度杀灭法的工艺研究 过度杀灭法假设的生物负荷和耐热性都高于实际数，而大多数微生物的 耐热性都比较低，很少发现自然生成的微生物的D121值大于0.5分钟。 因此，过度杀灭的灭菌程序理论上能完全杀灭微生物，从而能提供很高的 无菌保证值。由于该方法已经对生物负荷及耐热性

11、作了最坏的假设，故没 有必要对每一批次的被灭菌品进行微生物的监控。 2.2.1 1 湿热灭菌工艺的研究湿热灭菌工艺的研究 2. 2. 制剂湿热灭菌工艺 但这并不意味着生产过程中对微生物可以完全不加控制。即使对最终灭 菌产品设定了过度杀灭参数，仍应该在适当的时间间隔内对生物负荷及耐 热性进行监测。从控制热原的角度，也应当遵循工艺卫生规范，控制产品 的微生物污染。如果实际生产中能够严格遵循GMP的要求，这一点是可 以实现的。 过度杀灭要求的热能比较大，其后果是被灭菌品降解的可能性增大。 2.2.1 1 湿热灭菌工艺的研究湿热灭菌工艺的研究 2. 2. 制剂湿热灭菌工艺 2.1.3.残存概率法的工艺

12、研究 v残存概率法所需监控的指标包括被灭菌品生产开始阶段及常规生产阶段 指示菌（对灭菌程序呈现强耐热性的试验菌）以及生物负荷的信息。只有 对这些指标进行了有效的监控后，才能采用比过度杀灭法F0值低的热力灭 菌程序，同时产品的无菌保证水平不会降低。 v残存概率法更适合那些处方耐热性较差的最终灭菌产品。此法能够恰当地 杀灭生物负荷，同时避免产品发生不可接受的降解。此时灭菌程序的设计 就需同时考虑控制待灭菌产品的生物负荷及其耐热性。 v无菌保证值= F0 / D - lgN0 v其中，无菌保证值是SAL的负对数，N0为灭菌开始时产品中的污染微生 物总数，D为污染微生物的耐热参数。所以，灭菌工艺的无菌

13、保证值与F0、 N0、D密切相关。 2.1.3.1.灭菌前生物负荷的控制 v除了需要关注灭菌过程本身，还需要在生产过程中采用一 些适当的手段来监测和控制药品灭菌前的生物负荷。具体措 施通常包括灭菌前微生物数量与耐热性的监测、药液过滤、 工艺参数的控制等等。 v药液过滤：在确定工艺的过程中，也应该对滤膜的孔径、 材质、滤器的使用周期进行必要的筛选。 v在工艺参数控制方面，由于微生物在药液放置期间也会逐 渐繁殖，尤其一些营养型的注射液，如葡萄糖注射液等，其 环境更有利于微生物的生长和繁殖，因此应通过工艺筛选和 验证来确定溶液配制至过滤前、以及过滤后至灭菌前能够放 置的最长时限，并相应确定产品的批量

14、、生产周期等关键工 艺参数。 2. 2. 制剂湿热灭菌工艺 2.1.3.2.灭菌前微生物污染的监测 v灭菌前微生物污染水平的监测应在正常生产过程中取样并覆盖整个生产 过程，取样设计应选取生产过程中污染最大，最有代表性的样品，且要充 分考虑到产品从灌封到灭菌前的放置时间。一般而言，如果灌装持续一段 时间，可从每批产品灌装开始、中间及结束时分别取样。 v污染水平检查可采用薄膜过滤法，方法应经过验证，具体操作可参照中 国药典微生物限度检查法。 v对于最终灭菌且灭菌前生物负荷检查中发现污染菌的产品，应进行污染 菌耐热性的检查。污染菌的耐热性检查可以采用合适的测定方法，比如： 将样品或浸泡在药液中的收集

15、有污染菌的滤膜，在80100保温约 1030min，过滤，取滤膜培养，观察是否有菌生长。 2. 2. 制剂湿热灭菌工艺 v耐热性检查中任何幸存下来或生长的微生物都可以被假定为耐热菌，应采 用定时煮沸法将它和已知的生物指示剂的耐热性加以比较，必要时，可再 进一步测试耐热污染菌的D值，然后根据灭菌的F0值及污染菌的数量与耐热 性对产品的无菌做出评价。当产品微生物污染水平超标准时，应对污染菌 进行鉴别、调查污染菌的来源并采用相应的纠正措施。 2. 2. 制剂湿热灭菌工艺 2.2.1.物理确认 2.2.2 2 湿热灭菌工艺的验证湿热灭菌工艺的验证 物理确认所用的温度测试系统应在验证和/或试验 前后校准

16、，校准的频次应根据仪器设备的性能、验 证的时间的长短来确定。温度探头的精度至少为 0.15。 2.2.1.1.物理确认的前提 物理确认所涉及的灭菌设备，也应该在验证前经 过设备确认，其中应包括空载热分布试验。 2.2.1.2.装载热分布试验 2. 2. 制剂湿热灭菌工艺 装载热分布试验的目的是了解在装载条件下设备内部的温度分布状况 ，包括高温点、低温点的位置，为后续的评估和验证打下基础。装载热 分布一般在空载热分布的基础上进行。温度探头的个数和安装位置取决 于灭菌器的几何形状以及设备确认的结果，安装位置应包括可能的高温 点、低温点，灭菌柜温度控制探头处、靠近温度记录探头处。温度探头 应安放在待

17、灭菌容器的周围，注意不能接触待灭菌的容器。 装载热分布试验需要考虑最大、最小和生产过程中典型装载量情况， 进行试验时，应尽可能使用待灭菌产品。如果采用类似物，应结合产品 的热力学性质等(如粘度、比热容等)进行适当的风险评估。待灭菌产品 的装载方式和灭菌工艺的各项参数的设定应与正常生产时一致，应采用 适宜的方式（图表或照片）说明产品的装载情况，并评估探头放置是否 合理。如果待灭菌产品存在不同包装规格或浓度规格，应评估验证所采 用的样品和装载方式是否能充分反映所有样品的实际装载情况。每一装 载量的热分布试验需要至少连续进行三次。 2.2.1.3.热穿透试验 热穿透试验是考察灭菌柜和灭菌程序对待灭菌

18、产品适用性的一项试验 。热穿透试验的目的是确认产品内部也能达到预定的灭菌温度、灭菌时 间或F0值。一个好的灭菌柜和灭菌程序，既要使所有待灭菌产品达到一 定的F0值，以保障产品的SAL106，同时又不能使部分产品受热过度 而造成药物部分降解，以致同一灭菌批次的产品出现质量不均一。 热穿透试验的温度探头的个数和安装位置可参考装载热分布设置。一 般采用足够数量的温度探头，将热穿透温度探头置于药液中的冷点，即 整个包装中最难灭菌的位置。对于小容量注射液，如果有数据支持或有 证据表明将探头放在产品包装之外也能够反映出产品的热穿透情况，风 险能够充分得到控制，也可以考虑将探头放在容器之外。 热穿透试验的步

19、骤及要求与装载的热分布试验基本相同，每一装载方 式的热穿透试验也需要至少进行三次。以确定达到预期的无菌保障水平 对于F0值最大点位置（热点）的样品，由于其受热情况最为强烈，因 此应评估该位置下产品的稳定性情况，以进一步确认灭菌对于产品的稳 定性没有影响。 2. 2. 制剂湿热灭菌工艺 2. 2. 制剂湿热灭菌工艺 2.2.1.4.热分布和热穿透试验数据的分析处理 在物理确认试验中，应确认关键和重要的操作参数并有相应的文件和记录。 -保温阶段每个探头所测得温度的变化范围 -保温阶段不同探头之间测得的温度变化范围 -保温阶段探头测得的温度与设定温度之间的差值 -保温阶段探头测得超过设定温度的最短及

20、最长时间 -F0的下限及上限 -灭菌阶段结束时的最低F0值 -灭菌阶段的最低和最高压力 -饱和蒸汽温度和压力之间的关系 -灭菌阶段腔室的最低和最高温度 -热穿透温度探头之间的最大温差或F0的变化范围 -热分布试验中温度探头间的最大温差 -最长平衡时间 -最少正常运行的探头数 通常情况下，保温时间内 温度波动应在1.0之内 ，升、降温过程的温度波 动可通过总体F0值来反映 ，如果温度或F0值差别过 大，提示灭菌柜的性能不 符合要求、装载方式选择 不当等，需要寻找原因并 进行改进，重新进行验证 。 对于热敏感的药物，还应 该控制灭菌柜的升温和降温 时间，以保证热能的输入控 制在合理的范围以内，不会

21、 对产品的热稳定性造成影响 。 2. 2. 制剂湿热灭菌工艺 2.2.2.生物学确认 2.2.2 2 湿热灭菌工艺的验证湿热灭菌工艺的验证 v湿热灭菌工艺的微生物挑战试验是指将 一定量已知D值的耐热孢子（生物指示剂 ）在设定的湿热灭菌条件下灭菌，以验证 设定的灭菌工艺是否确实能使产品达到预 定的无菌保证水平。生物指示剂被杀灭的 程度，是评价一个灭菌程序有效性的直观 指标。 2.2.2.1.生物指示剂选用的一般原则 v一般情况下，生物指示剂选择的原则性要求是：孢子稳定、非致病菌、 易于培养、有效期长、保存及使用方便、安全性好。注意所用的生物指示 剂的耐热性应强于待灭菌产品中的污染菌。 v常用的生

22、物指示剂：嗜热脂肪芽孢杆菌，生孢梭菌、枯草芽孢杆菌等。 过度杀灭法：嗜热脂肪芽孢杆菌的孢子，或其他D值大于1的芽孢。 残存概率法：耐热性可以小于嗜热脂肪芽孢杆菌的孢子。 2.2.2.2.生物指示剂的使用和放置 v实际验证过程中可以将生物指示剂接种在待灭菌产品上或直接采用市售 的生物指示剂成品，残存概率法推荐采用直接接种法。 2. 2. 制剂湿热灭菌工艺 v对于具体的品种而言，如果需要将生物指示剂接种至产品之中，应测定 生物指示剂在该产品中的耐热性，即D值。 v生物指示剂的用量需要根据生物指示剂在待灭菌样品中的耐热性来确定 ，其用量应符合挑战性试验的要求。生物指示剂的用量可以采用阴性分数 法或者

23、残存曲线法计算，可以根据实际情况选择合适的计算方法。 2.2.2.3.灭菌 v生物指示剂的验证应该按照产品设定的灭菌工艺进行灭菌。每个产品的 每个规格的每一灭菌程序，至少需要连续进行三次生物指示剂验证试验。 2.2.2.3.检查和培养 2.2.2.2.生物指示剂的使用和放置 v装有生物指示剂的容器应紧挨于装有测温探头的容器，在灭菌设备的冷点 处必需放置生物指示剂。灭菌柜的其他部位应装载产品或者类似物，以尽 可能的模仿实际生产时的状况。 v完成灭菌周期后，尽快将指示剂放入培养基中进行培养。需要注意不同 的生物指示剂所需要的培养条件也各不相同，应根据所用生物指示剂的特 性和供应商的说明书来确定培养

24、条件，同时应放置阳性对照样品。 2.2.2.3.试验结果的评价 v根据生物指示剂的D值和接种量推算产品在灭菌过程中实际达到的SAL值 。如果各次验证的结果不一致，需要分析原因，采取相应的改进措施后重 新进行验证工作。 3 3. .制剂无菌生产工艺制剂无菌生产工艺 3.1.无菌生产工艺的研究 -无菌药品应首选终端灭菌工艺。如不能耐受 终端灭菌工艺条件，应确定是否能通过优化处 方工艺，以改善其耐热性且不影响其他关键质 量属性。如经充分的研究证实产品无法耐受终 端灭菌工艺，则可考虑能否通过除菌过滤工艺 进行过滤除菌，如果可以，即可采用除菌过滤 和无菌工艺相结合；如果不可以，则可考虑采 用无菌分装和无

25、菌工艺相结合。 3 3. .制剂无菌生产工艺制剂无菌生产工艺 3.1.1. 过滤除菌工艺的研究 -过滤除菌工艺是通过除菌过滤器，将药液中的微生物除去而得到无菌 滤液。采用过滤除菌工艺时，工艺研究和生产过程控制的重点是影响无 菌保证水平的工艺步骤和工艺参数，主要包括物料（如原料药、辅料、 内包装材料等）的质量控制、除菌过滤器的选择、除菌过滤工艺参数的 研究、除菌过滤生产过程的控制等。 -对于采用过滤除菌生产工艺的制剂，需注意对配制药液使用的原料药 、辅料（包括注射用水）等原材料的微生物负荷进行检查，掌握潜在的 污染微生物的总体特性情况，通过研究确定相应的质控标准。 -过滤除菌生产工艺所使用的除菌

26、过滤器，通常为标称孔径0.2微米（ 0.22微米）或更小的除菌级的过滤器。除菌过滤器的过滤效能是评价除 菌过滤工艺的重要参数，需要进行相应的研究和验证。 3.1.1. 过滤除菌工艺的研究 -通常，影响除菌过滤器的除菌过滤效能的因素包括： 药液的性质，如药液的粘度、表面张力、pH值、渗透压等； 过滤步骤的工艺参数，如过滤的压力、流速、时间、温度等； 除菌过滤器与所过滤的药液的相互作用，如除菌过滤器与药液的相容 性、除菌过滤器的过滤总量和使用周期等。 3 3. .制剂无菌生产工艺制剂无菌生产工艺 -在实际生产过程中，过滤除菌前通常应进行过滤器完整性检测，过滤 除菌后必须要进行过滤器完整性检测。 -

27、由于微生物通过除菌过滤器的概率随着待过滤溶液中微生物数量的增 加而增加，除菌过滤工艺中需对待过滤溶液的微生物负荷情况进行研究 和控制。同时应通过研究确定无菌生产各操作环节的时间控制范围，如 料液配制后待过滤的存放时间、药液过滤操作的时间、过滤后至灌装前 放置的时间、灌封操作的时间、灭菌后的内包装材料及密封件允许的放 置时间、除菌过滤器的过滤总量和使用周期等。 3 3. .制剂无菌生产工艺制剂无菌生产工艺 3.1.2. 无菌分装工艺的研究 3 3. .制剂无菌生产工艺制剂无菌生产工艺 -无菌分装生产工艺是将采用经验证的灭菌/除菌工艺过程处理后的原料 药或者原料药和辅料，用无菌操作的方法分装到采用

28、经验证的灭菌工艺 处理的容器中，密封得到的。 -无菌分装工艺的工艺研究和生产过程控制的重点同样是影响无菌保证 水平的工艺步骤，主要包括物料（包括原料药、辅料、内包装材料等） 的质量控制、物料暴露于环境中可能再污染的操作步骤等。 -关于物料的质量控制，采用无菌分装工艺的制剂所涉及的所有物料， 都必须采用适当的灭菌/除菌工艺处理后方可使用。各物料的灭菌/除菌工 艺，都应经过验证、进行监测，并受到良好的控制。同时需要对各物料 的无菌性、细菌内毒素水平等进行严格控制，通过研究确定相应的质控 标准。 -原料药或者原料药和辅料的分装步骤是影响产品质量和无菌保证水平 的关键生产步骤，应结合生产设备和产品特点

29、进行工艺参数（如分装速 度和分装时间等）的研究，并确定相应的工艺控制标准。 3.2. 无菌生产工艺的验证 3 3. .制剂无菌生产工艺制剂无菌生产工艺 -无菌生产工艺能否达到设定的无菌保证水平，与整个生产过程的控制 密切相关，应按照GMP要求及产品具体生产工艺情况进行生产环境和生 产过程的控制，应对无菌生产工艺进行验证。 -无菌生产工艺验证应包括最差条件。在实际生产过程中，对生产过程 和工艺参数的控制均不能超过经验证的最差条件的控制范围。 -培养基模拟灌装试验是无菌生产工艺验证的重要部分，应尽可能模拟 常规的无菌生产工艺，并包括所有对无菌保证水平有影响的操作，以及 生产中可能出现的各种干预和最

30、差条件。 培养基模拟灌装试验的首次验证，应当连续进行3次合格试验。在生产 用的设备、设施、人员结构及工艺方法有重大变更时都应重复进行培养 基模拟灌装试验。对于除菌过滤工艺的验证，还包括对除菌过滤系统的 验证，如过滤器的微生物截留验证、过滤器与待过滤药液的相容性验证 等。 3.2.1. 培养基模拟灌装试验 3 3. .制剂无菌生产工艺制剂无菌生产工艺 3.2.1.1. 培养基 -培养基模拟灌装试验需要选择合适的培养基，并对培养基的质量进行 控制。 -应当根据产品的剂型、培养基的选择性、澄清度、浓度和灭菌的适用 性选择培养基。一般选用胰胨大豆肉汤培养基（TSB），某些特殊情况 下也可以选用厌氧生长

31、培养基，如硫乙醇酸盐培养基（FTM）。 -应关注培养基的微生物促生长性能，在按照标准操作规程制备培养基 后，可参考中国药典附录进行培养基微生物促生长性能试验，确认所制 备的培养基出现明显的所接种的微生物的生长。 -用于无菌分装工艺验证的培养基，应关注无菌性检查，可参考中国药 典附录进行，结果应符合规定。 3 3. .制剂无菌生产工艺制剂无菌生产工艺 3.2.1.1. 培养基 -在培养基模拟灌装试验中，需进行阳性对照试验，即取低浓度的菌种 接种于进行阳性试验用的对照容器中，与培养基模拟灌装试验在同一条 件下进行培养。除了中国药典附录中规定的阳性菌，建议使用生产环境 中常见的微生物，或者在同一生产

32、环境中曾被检出过的菌种。接种量一 般每个容器10100CFU，每个菌种接种2瓶，通常需均证实有菌生长， 该培养基模拟灌装试验方有效。 -如果试验中需要使用模拟分装用粉末，同样需要对模拟分装用粉末进 行选择和质量控制。模拟分装用粉末的选择一般遵循以下原则：可以 在干粉状态下灭菌，灭菌后的无菌性达到药典规定的标准；流动性较 好，可以用分装机分装；可溶于液体培养基；在模拟试验应用的浓 度下无抑菌性。常用的模拟分装材料有乳糖、甘露醇、PEG6000、 PEG8000等，也可以采用培养基干粉作为模拟分装用无菌粉末。 3 3. .制剂无菌生产工艺制剂无菌生产工艺 3.2.1.2. 模拟无菌生产工艺的操作过

33、程 -培养基模拟灌装试验中使用的内包装材料的清洗、灭菌，分装设备的 清洗、消毒及与产品接触的分装设备部件的清洗、灭菌、安装过程均应 遵循与实际生产操作相同的标准操作规程。 -应当注意有足够数量的培养基与容器的内表面充分接触，灌装培养基 时，每个容器的灌装体积一般为1/3-1/2之间，最多不能超过容器的85% 。 -对于冻干粉针剂的验证试验，在培养基灌装半压塞后，只需模拟样品 进入和移出冻干机的过程即可，而不必完全模拟整个冻干过程，以保证 一旦有细菌，能够保持较好的生存能力。 -可模拟一些可能造成污染的操作步骤，如抽真空，充氮（验证中应使 用压缩空气代替）等步骤。 3 3. .制剂无菌生产工艺制

34、剂无菌生产工艺 3.2.1.2. 模拟无菌生产工艺的操作过程 -培养基模拟灌装试验应尽可能模拟常规的无菌生产工艺，应包括所有 对无菌保证水平有影响的关键操作，包括生产中可能出现的各种干预和 最差条件。各种干预和最差条件的考虑需要体现风险控制的理念。 -通常可能出现的各种干预和最差条件包括：人员数量和他们的活动 、换班、休息等；设备调试，正常停车、非正常停车、意外事故（如 检修等）；采用灭菌后所允许放置的最长时间的设备或者车间进行生 产；模拟生产时间最长的批量所需的时间；采用最慢的填充速度和 最大的包装容器（即最长的暴露时间）；采用最快的填充速度和最小的 包装容器（即容易伴随更多干预的生产情况）

35、。 -在试验计划中，总体研究设计和运行时间应该模拟可能出现的各种干 预和最差操作条件，覆盖所有实际生产过程涉及的操作。 -培养基模拟灌装的数量应当足以保证评价的有效性，批量较小的产品 ，培养基模拟灌装的数量应当至少等于产品的批量。 3 3. .制剂无菌生产工艺制剂无菌生产工艺 3.2.1.3. 试验结果的评价 -培养基模拟灌装试验需要对所有灌装样品进行培养和无菌检查。培养 基模拟灌装试验的目标是零污染，应当符合以下要求： 灌装数量灌装数量允许的污染数量允许的污染数量 少于5000支时不得检出污染品 5000至10000支时 有1支污染，需调查，可考虑重复试验； 有2支污染，需调查后，进行再验证

36、 超过10000支时 有1支污染，需调查； 有2支污染，需调查后，进行再验证 -一旦发现污染，需要进行偏差调查，包括污染菌的鉴别、污染情况的 评估、是否可以重复进行试验等等。 3.2.1. 除菌过滤系统的验证 3 3. .制剂无菌生产工艺制剂无菌生产工艺 -除菌过滤系统的验证一般包括微生物截留研究、相容性研究（包括可 提取物和浸出物研究、化学兼容性研究和吸附研究）。 3.2.2.1. 微生物截留研究 -验证目的验证目的：除菌过滤器微生物截留试验是通过模拟实际过滤工艺，过 滤含有一定量生物指示菌的产品溶液或者产品替代溶液，确认除菌过滤 器的微生物截留能力。 -过滤器的微生物截留验证的设计： -a

37、、挑战用微生物的选择 通常采用缺陷性假单胞菌作为挑战性试验用菌；如果使用其他细菌，应 保证该细菌足够细小至足以挑战除菌级别过滤器的截留性能，并能代表产 品中发现的最小微生物。应尽可能的进行微生物负荷的鉴别和量化研究， 掌握所分离的微生物的形态学特征，为挑战性微生物的选择提供依据。 a、挑战用微生物的选择 -挑战性微生物的大小可以通过其可穿过0.45微米级别的滤膜来确证。 通常情况下，标准培养条件下生长的缺陷性假单胞菌，在高挑战浓度（ 如107/cm2）时，能少量穿过0.45微米级别的滤膜。 3.2.2.1. 微生物截留研究 -b、微生物截留试验条件 在试验室模拟生产工艺条件，将定量缺陷性假单胞

38、菌加入到挑战溶液中 进行过滤，缺陷性假单胞菌的加入量应当能够在预定的时间内提供稳定的 挑战浓度，并应尽可能确认缺陷性假单胞菌的单分散性状态。挑战溶液应 尽可能使用实际产品。 微生物截留试验过程中的压差应达到或超过实际生产过程的最大压差和/ 或单位面积的最大流速（在过滤器制造商的设计规范内）。 微生物截留验证研究应包括多个批次的滤膜（通常三个批次），其中至 少应有一个批次，其预研究时或物理完整性测试时的数值符合但是接近（ 例如，10之内）过滤器生产商提供的合格规范限值。 3 3. .制剂无菌生产工艺制剂无菌生产工艺 3 3. .制剂无菌生产工艺制剂无菌生产工艺 3.2.2.1. 微生物截留研究

39、c、微生物截留验证研究中使用的过滤膜的物理完整性检测数值 应包括在试验报告中。 物理完整性检测应使用具有标准值的物料进行，如水、70%异丙醇、或其 他溶液。微生物挑战试验前后均应进行完整性测试。 物理完整性检测应使用具有标准值的物料进行，如水、70%异丙醇、或其 他溶液。微生物挑战试验前后均应进行完整性测试。 如果微生物截留验证研究中，在过滤器的下游检测到测试用微生物，则应 进行调查。如果调查确认测试用微生物能穿透完整性检测达标的过滤器， 那么就应重新考虑此种过滤器在这些工作条件下的适用性。 除菌过滤时不推荐重复使用过滤器。如果需要重复使用除菌级过滤器，需 要说明理由，并对重复使用的相关参数（

40、如最多处理批次、过滤量等）进 行严格的验证后确定相应的范围。 3 3. .制剂无菌生产工艺制剂无菌生产工艺 3.2.2.2. 相容性研究 a、可提取物和浸出物研究 可提取物可提取物指在人为或挑战性条件（如溶剂、温度或时间）下，从过滤器中脱离的任 何化学组分。通过可提取物的研究，可以尽可能多地了解过滤器组件材料中可能被提 取出来的物质，并据此建立专属、灵敏、可行的分析方法。浸出物浸出物是指在正常储存或 使用条件下，从过滤器中进入产品或溶液中的物质。 潜在的可提取物或浸出物的来源包括但不限于：膜组件（如：成形剂、表面活性剂 、抗氧化剂、残留溶剂、支架层）和塑料组件（如：封盖、外壳、支架、O型圈）。

41、 影响因素包括灭菌方法、过滤液的化学性质、接触时间、温度、过滤量与面积之比等 。 考虑到可提取物的来源不同和影响因素较多，建议过滤器使用者在开展研究时尽可 能使用实际产品，并使用与实际生产相同类型的过滤器。当产品会干扰分析方法或产 品过于昂贵等时可使用替代溶液，替代溶液必须与待过滤产品性质尽可能一致，能代 表产品的溶解性作用和化学特性。 3 3. .制剂无菌生产工艺制剂无菌生产工艺 a、可提取物和浸出物研究 确定了用于可提取物试验的萃取溶液（产品、替代液或几类 溶液合并使用）后，在后续试验设计时应模拟实际生产条时的 最差条件，具体可考虑温度、时间、pH值和预处理（如：冲洗 、灭菌）工序等关键变

42、量。可提取物试验应采用过滤装置处于 最差条件时的接触时间和温度，使用灭菌后的过滤器来完成。 可以用静态浸泡或循环流动的方法。采用静态浸泡法时，过滤 器在给定温度的萃取溶液中浸泡一段既定的时间。而采用循环 流动法时，萃取液在既定的时间内循环反复穿越过滤器。将萃 取液收集并检测，从而确定其中的过滤器可提取物。 在取得过滤器萃取液后，通过分析可以确定来自过滤器的物 质种类和含量，分析方法可包括非挥发性残留物、紫外光谱、 红外光谱、气相色谱-质谱、液相色谱-质谱、总有机碳分析等 。除了对过滤器可提取物的种类和含量进行确定外，必要时还 可以采用已被认可的生物反应性试验对其安全性进行评估。 3.2.2.2. 相容性研究 3 3. .制剂无菌生产工艺制剂无菌生产工艺 b、化学兼容性研究 过滤器的化学兼容性研究用来评估过滤装置与料液的化学相容性，以避免 可能的过滤器受损或变形，并能防止料液受到释放物或微粒物质的污染。化 学兼容性试验应涵盖整个装置，试验的设计应考虑料液性质、过滤温度和接 触时间等。由于过滤装置与过滤料液或溶剂之间可能存在诸多化学相互作用 ，过滤器生产商所提供的代表性的化学兼容性表通