流式细胞术检测T细胞亚群

1、流式细胞术检测T T细胞亚群 组组 长：长： 杜建呈杜建呈 小组成员：小组成员： 李李 姚姚 田田 呈（讲解）呈（讲解） 罗光珍罗光珍 范成芬范成芬 钱洪珍钱洪珍 目 的 1 2 3 4 了解流式细胞术的基本发展过程了解流式细胞术的基本发展过程 掌握流式细胞术的基本原理及应用掌握流式细胞术的基本原理及应用 掌握分选掌握分选T T细胞亚群的原理与方法细胞亚群的原理与方法 掌握掌握T T细胞亚群分选的意义细胞亚群分选的意义 验 实一 1934年 Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等首次提出了使悬浮的单个血红细胞等 流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，流过玻璃毛细管，在亮视野下

2、用显微镜进行计数， 并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们 还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺 次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块 的淤阻的淤阻。 1953年 Crosland Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管根据雷诺对牛顿流体在圆形管 中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液 流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的 流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室

3、，使流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使 待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过， 外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。 这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。 二，流式细胞术的发展史 19561956年，Coulter Coulter 在多年研究的基础上利用 Coulter Coulter 效应生产了效应生产了Coulter 计数器。其基本原理是：使细计数器。其基本原理是：使细 胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存胞通过一个小孔，只在细

4、胞与悬浮的介质之间存 在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特 性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和 个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。 1967年年 Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染等设计了通过汞弧光灯激发荧光染 色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。 1973年年 Steinkamp设计了一种利用激光激发双色设计了一种利用激光激发双色 荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行荧光色素标记的细胞，既能分析计

5、数，又能进行 细胞分选的装置。这样就基本完成了现代细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数计数 技术的主要历程。技术的主要历程。 现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发 源的源的，其开拓者是其开拓者是Kamentsky。1965年，他在组织年，他在组织 化学的基础上提出了两个新设想化学的基础上提出了两个新设想 1）细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的，）细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的， 即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学 的重要信息。的重要信息。 2）细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从）细胞的不同组分可以同时进行多参

6、数测量，从 而可以对细胞进行分类。换句话说，对同一细胞而可以对细胞进行分类。换句话说，对同一细胞 可以同时获得有关不同组分的多方面的信息，用可以同时获得有关不同组分的多方面的信息，用 作鉴别细胞的依据。作鉴别细胞的依据。 流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是Van Dilla 和美国的和美国的Los Alamos小组。他们在小组。他们在1967年研制出流液束、年研制出流液束、 照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基 础上，首次用荧光础上，首次用荧光Feulgen反应对反应对DNA染色显示出染色显示出DNA的活的活 性与荧光之间存在

7、着线性关系，并在性与荧光之间存在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚的直方图上清楚 地显示出细胞周期的各个时相。地显示出细胞周期的各个时相。Gohde 和和Dittrich接着把这接着把这 项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研 究细胞药代动力学问题。究细胞药代动力学问题。FCM用于免疫组织化学中的关键用于免疫组织化学中的关键 是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并 没有多大差异。没有多大差异。 流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计流式细胞术主要包括了样品的

8、液流技术、细胞的分选和计 数技术，以及数据的采集和分析技术等。数技术，以及数据的采集和分析技术等。 三，流式细胞术的基本原理及应用 一一） 流式细胞术（流式细胞术（FCMFCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构）是一种可以对细胞或亚细胞结构 进行快速测量的新型分析技术和分选技术。进行快速测量的新型分析技术和分选技术。 1 1，其基本原理是将悬浮分散的单细胞悬液，经特，其基本原理是将悬浮分散的单细胞悬液，经特 异荧光染料染色后，放入样品管。异荧光染料染色后，放入样品管。 2 2，在气体压力的作用下，悬浮在样品中的单细胞悬液形成，在气体压力的作用下，悬浮在样品中的单细胞悬液形成 样品流垂直进入流式细胞

9、仪的流动室，沿流动室的轴心向样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向 下流动，流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕下流动，流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕 细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆 柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直 相交相交点称为测量区。相交相交点称为测量区。 3 3，染色的细胞经照射发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别，染色的细胞经照射发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别 被呈被呈90900 0角方向放置的光电倍增管荧光

10、检测器和前向角放置的光电角方向放置的光电倍增管荧光检测器和前向角放置的光电 二极管散射光检测器接收，经过转换器转换为电子信号后，经膜二极管散射光检测器接收，经过转换器转换为电子信号后，经膜/ / 数转换输入计算机。数转换输入计算机。 4 4，计算机通过相应的软件储存，计算，分析这些数字化信息，就，计算机通过相应的软件储存，计算，分析这些数字化信息，就 可以得到细胞的大小和活性，核酸含量，酶和抗原的性质等物理和可以得到细胞的大小和活性，核酸含量，酶和抗原的性质等物理和 生化指标。生化指标。 二） 三）流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理 n参数测量原理：流式细胞仪可以同时进行参数测量原理：流

11、式细胞仪可以同时进行 多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号 和非荧光散射信号。和非荧光散射信号。 n样品分选原理：流式细胞仪的分选功能是样品分选原理：流式细胞仪的分选功能是 由细胞分选器来完成的。由细胞分选器来完成的。 n数据处理原理：数据处理原理：FCMFCM的数据显示方式包括的数据显示方式包括 单参数直方图（单参数直方图（histogram)histogram)，二维点图，二维点图 （dotplotdotplot），二维高等图（），二维高等图（contourcontour），假三），假三 维图（维图（pseudo 3Dpseudo 3D）和列表模式（

12、）和列表模式（list modelist mode） 等。等。 四，T T细胞亚群的检测 1，实验内容，实验内容：流式细胞术检测CD4+，CD8+T细胞。 2，实验原理，实验原理（1 1）：T淋巴细胞具有高度的异质性， 根据 其表面的标志和功能特征，可分为若干个亚 群，各亚群之间相互调节，共同发挥其免疫学功能。 因此，对淋巴细胞亚群数量的检测能反映机体的免 疫功能状态。本次实验用流式细胞术检测 CD4+,CD8+T细胞。（流式细胞术原理见前面流式细 胞术的基本原理及应用） 实验原理（2 2） T淋巴细胞表面的淋巴细胞表面的CD分子与相应荧光素直分子与相应荧光素直 接标记的抗人接标记的抗人CD分

13、子分子McAb结合后，细胞表结合后，细胞表 面形成带有荧光色素的抗原抗体复合物。经面形成带有荧光色素的抗原抗体复合物。经 激光激发后发出与荧光素相对应的特定波长激光激发后发出与荧光素相对应的特定波长 的荧光，其荧光强度与被测的荧光，其荧光强度与被测CD分子表达密度分子表达密度 成正比例关系，由此通过流式细胞仪课检测成正比例关系，由此通过流式细胞仪课检测 结合含有相应荧光素标记抗体的阳性细胞百结合含有相应荧光素标记抗体的阳性细胞百 分率。分率。 3实验材料：实验材料： （1）,肝素抗凝人全血肝素抗凝人全血 （2）,荧光标记单克隆抗体：抗人荧光标记单克隆抗体：抗人CD4-FITC,抗人抗人CD8-

14、PE(美国美国BD公司产公司产 品）品） （3）,细胞洗液（含细胞洗液（含1%FCS的的PBS) （4）,红细胞裂解液红细胞裂解液 （5）,细胞固定液细胞固定液 （25%戊二醛戊二醛3.2ml， 葡萄糖葡萄糖2.0g加无血清细胞洗液至加无血清细胞洗液至 100ml）。）。 . . （6）,FACS缓冲液缓冲液 1 PBS 950ML FCS 40ml 10%叠氮钠溶液叠氮钠溶液 10ml . （7）,仪器缓冲液（仪器缓冲液（FACS-flow),FACS清洁液（清洁液（FACS clean)和和FACS洗净液洗净液 （FACS rinse)由仪器厂家提供。由仪器厂家提供。 （8）,流式细胞仪。

15、流式细胞仪。 （9）离心机，吸管，试管等。）离心机，吸管，试管等。 4，实验步骤 混匀抗凝全血，加混匀抗凝全血，加100ul全血于试管中，分别加入抗人全血于试管中，分别加入抗人 CD4-FITC,CD8-PE单克隆荧光抗体各单克隆荧光抗体各10ul，用振荡器混匀，用振荡器混匀， 避光放置避光放置1530min（室温（室温200C250C) 加入溶血素加入溶血素2ml溶解红细胞，与振荡器上混匀，室温避光溶解红细胞，与振荡器上混匀，室温避光 放置放置10min，1000rpm离心离心10min，弃上清液。，弃上清液。 加入加入PBS缓冲液（有缓冲液（有0.1%的的NaN3）1ml洗细胞，洗细胞，1

16、000rpm 离心离心10min，倾去上清液，加入固定液，倾去上清液，加入固定液300ul重悬细胞，重悬细胞，BD- FACBCalibur流式细胞仪检测。流式细胞仪检测。 细胞的吸入，将装有细胞的细胞的吸入，将装有细胞的FACS测定管放置到机器吸管测定管放置到机器吸管 孔处，先预检测样品，然后进行实际检测。课根据细胞的孔处，先预检测样品，然后进行实际检测。课根据细胞的 浓度选择测定的速度（低，中或高）。所有的数据将自动浓度选择测定的速度（低，中或高）。所有的数据将自动 存入微机。存入微机。 5使用后的清洗 将装将装FACS清洁液的清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入管放置机器吸管孔，高

17、速吸入 1min 将装将装FACS洗净液的洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入管放置机器吸管孔，高速吸入 1min 再将装再将装FACS清洁液的清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入管放置机器吸管孔，高速吸入 5min 同样再将装同样再将装FACS洗净液的洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速管放置机器吸管孔，高速 吸入吸入5min 最后将一装有双蒸水的最后将一装有双蒸水的FACS管放置机器吸管孔，关闭机管放置机器吸管孔，关闭机 器。器。 将废液槽中的废液倒掉，并清洗干净废液槽。将废液槽中的废液倒掉，并清洗干净废液槽。 6 6，FCMFCM分析 n 7 7，结果判断： n如上图所示，CD3+T细胞占细胞总数的66.82%，其中 CD4+T细胞占51.59%，CD8+T T细胞占14.83% 。 8 8，注意事项： 确保细胞悬液上机检测前浓度为1 110105 5/ /mlml, ,细胞浓度过低直 接影响检测结果。 使用蛋白封闭剂，封闭非特异结合实际位点，常用的蛋白 封闭剂为0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。 设置对照样品，采用与抗体来