测序技术与基因组测序

1、测序技术及基因组测序测序技术及基因组测序 报告组成员：杜聪聪报告组成员：杜聪聪 韩韩 栋栋 余余 轩轩 韩韩 东东 汇汇 报报 人：人： 韩韩 栋栋 摘要摘要： v 目前在人类和动物基因组学的研究领域，HT-NGS技术已 成为最热门的话题,与最复杂的基于Sanger方法的的毛细 管测序仪技术相比，它可以产生100倍以上甚至更多的数 据。随着高通量测序仪器的不断发展和现代生物信息学工 具的快速进步，仅用1000美元来进行个体基因组测序的预 定目标，在不久的将来似乎可以实现。自2005年以来的相 当短的时间范围内，HT-NGS技术正在通过染色质免疫沉 淀联合DNA微阵列（ChIP-chip）或测序

2、（ChIP-seq）， RNA测序（RNA-seq），全基因组基因分型，全基因组结 构变异，基因组的从头装配和重装配，突变检测和载体筛 选，遗传紊乱和复杂人类疾病的检测，DNA文库制备，双 末端和基因组捕获，线粒体基因组的测序和个体基因组学 而变革人类和动物基因组研究。 摘要摘要： v在这篇综述中，我们描述了HT-NGS的重要特征 ，第一代DNA测序仪，HT-NGS的起源，第二代 HT-NGS平台，第三代HT-NGS平台：包括单分子 Heliscope，SMRT和RNAP测序仪，Nanopore， Archon Genomics X PRIZE基金会，第二代和第 三代HT-NGS平台的比较，应

3、用，进展和测序技 术对人类和动物基因组研究的未来前景。 关键词关键词： v基因组芯片技术 芯片测序技术 从头装配 高 通量新一代测序技术 个体基因组学 重测序技 术 RNA测序技术 引言引言 v人类基因组草案的完成只是现代DNA测序时代的 开始。 v成熟的HT-NGS技术在一定程度上满足我们预期 的高效测序和低花费需要，在哺乳动物基因组研 究中具有潜在的应用价值。 vHT-NGS技术是当今基因组研究中最大的挑战之 一。 v完全理解人类基因组变异的经济特征,对疾病的遗 传易感性 ,和药物反应的基因治疗将成为接下来 十年基因组学研究的核心目标。 引言引言 v 2011年是人类基因组测序十周年纪念。

4、在这十年期间，年是人类基因组测序十周年纪念。在这十年期间， 基因组测序领域取得了惊人的成就：包括人类基因组的解基因组测序领域取得了惊人的成就：包括人类基因组的解 码，新时期人类基因组研究程序方面技术的大幅进步，针码，新时期人类基因组研究程序方面技术的大幅进步，针 对个性化基因的研究，稀有变异体的发现及其基因的研究对个性化基因的研究，稀有变异体的发现及其基因的研究 ，利用基因测序来了解基因序列对癌症、哺乳动物进化和，利用基因测序来了解基因序列对癌症、哺乳动物进化和 人口结构的影响等。人口结构的影响等。 v 基因组学领域技术的不断进步使人类的视野和期望得以提基因组学领域技术的不断进步使人类的视野和

5、期望得以提 升，尤其是升，尤其是HT-NGS技术的广泛应用技术的广泛应用。 v 随着具有潜力的随着具有潜力的HT-NGS技术和组装方法的发展加快了新技术和组装方法的发展加快了新 型基因组被测定的速度。现在可以组装新的大型基因组型基因组被测定的速度。现在可以组装新的大型基因组, 一个很好的例子就是源于大熊猫中的基因的装配一个很好的例子就是源于大熊猫中的基因的装配(Li et al. 2010b)，该新型基因组小片段序列的读取就利用了新一代该新型基因组小片段序列的读取就利用了新一代 DNA测序技术。测序技术。 第一代第一代DNA测序仪测序仪 2021-7-26 第一代第一代DNA测序仪测序仪 v

6、1977年，年，DNA测序方面两篇具有里程碑意义的文章发表测序方面两篇具有里程碑意义的文章发表 ，即弗雷德里克，即弗雷德里克桑格尔的桑格尔的基于链末端双脱氧核苷酸类似基于链末端双脱氧核苷酸类似 物的酶双脱氧物的酶双脱氧DNA测序技术测序技术，和艾伦、沃尔特的，和艾伦、沃尔特的化学降解化学降解 法测定法测定DNA序列技术，化学降解法最终产生的带有标志的序列技术，化学降解法最终产生的带有标志的 DNA片段利用特定的方法得以分开，并借助凝胶电泳技术片段利用特定的方法得以分开，并借助凝胶电泳技术 将其分离开将其分离开。 v 另一具里程碑意义的是另一具里程碑意义的是第一个小噬菌体基因组第一个小噬菌体基因

7、组(长度为长度为 5386个碱基个碱基)DNA测序的实现和高达测序的实现和高达3亿个碱基的人类基亿个碱基的人类基 因组测序的成功因组测序的成功完成完成。 值得一提的是值得一提的是,这一进展已被用于这一进展已被用于 1977年桑格尔引进的基础年桑格尔引进的基础“双脱氧的方法双脱氧的方法”的改进的改进 。 HT-NGS技术的诞生技术的诞生 v 2000年年,乔纳森乔纳森罗思伯格创立了罗思伯格创立了454生命科学公司生命科学公司, 该公司该公司 进一步发展成为第一个商业化的有效的平台进一步发展成为第一个商业化的有效的平台,即即GS 20。该。该 仪器得以进一步发展成为为市场上仪器得以进一步发展成为为

8、市场上第一代第一代NGS系统系统。 v 在接下来的几年里在接下来的几年里,罗氏应用从罗氏应用从454生命科学公司获得的技生命科学公司获得的技 术，并进一步拓展出术，并进一步拓展出454仪器的新类型仪器的新类型,即即GS FLX titanium。 v 斯德哥尔摩瑞典团队首次提出一种斯德哥尔摩瑞典团队首次提出一种新的测序方法新的测序方法，该方法，该方法 基于在聚合酶介导的脱氧核糖核苷酸合成过程中释放的焦基于在聚合酶介导的脱氧核糖核苷酸合成过程中释放的焦 磷酸盐的化学检测来进行测定磷酸盐的化学检测来进行测定 (Nyren et al. 1993, Nyren 2007)，并且可以通过对释放的焦磷酸

9、盐的检测进行即时，并且可以通过对释放的焦磷酸盐的检测进行即时 测序测序 (Ronaghi et al. 1998)。 v 2007年年HT-NGS技术被选为对哺乳动物基因组学研究有重技术被选为对哺乳动物基因组学研究有重 大影响的方法并开辟出新机遇大影响的方法并开辟出新机遇 。 第二代第二代HT-NGS技术平台技术平台 v目前目前， Roche，Illumina, SOLiD三种领先的三种领先的第第 二代二代HT-NGS技术技术(Fig. 1)在商业上已可应用，更在商业上已可应用，更 多有效的方法的开发速度也在不断加速多有效的方法的开发速度也在不断加速。 v2008年年,美国国家人类基因组研究所

10、美国国家人类基因组研究所(NHGRI)启动启动 资金来进行极具革命性的基因组测序技术项目，资金来进行极具革命性的基因组测序技术项目， 旨在花费旨在花费1000美元美元甚至更少来测序人类基因组甚至更少来测序人类基因组。 第三代第三代HT-NGS技术平台技术平台 v 前面讨论的第二代前面讨论的第二代HT-NGS技术，原理基于技术，原理基于PCR扩增扩增DNA 片段，进而使光信号足够强可用片段，进而使光信号足够强可用CCD照相机来进行碱基检照相机来进行碱基检 查查。尽管。尽管PCR扩增已经彻底改变了扩增已经彻底改变了DNA分析分析,但在某些情但在某些情 况下它可能引起碱基序列的错误或支持某些序列长度

11、过长况下它可能引起碱基序列的错误或支持某些序列长度过长 ,从而从而在在扩增前存在各种基因片段的相对频率和吸光度发扩增前存在各种基因片段的相对频率和吸光度发 生改变。为了克服这个问题生改变。为了克服这个问题 并将其最终小型化到纳米级并将其最终小型化到纳米级 水平及最小的可使用的生化药品，如果水平及最小的可使用的生化药品，如果序列可以从单个序列可以从单个 DNA分子直接测定分子直接测定,而不需要而不需要PCR扩增这将是可以实现的扩增这将是可以实现的 ，并且其潜在的丰度水平的失真也是可以避免的，并且其潜在的丰度水平的失真也是可以避免的。对单个。对单个 DNA分子进行测序这一技术现被称为分子进行测序这

12、一技术现被称为“第三代第三代HT-NGS技技 术术 (Schadt et al. 2010)。 掠过先前的扩增步骤边合成边掠过先前的扩增步骤边合成边 测序的理念目前是大多数公司所追求的。测序的理念目前是大多数公司所追求的。 Heliscope 单分子测序仪单分子测序仪 v对单个DNA分子测序技术首次由 Braslavsky 于 2003年引入，并于2007年作为第一代商业单分子 DNA测序系统被生物科学所认可。 vHeliscope测序仪的原理基于“准确的单分子测序 技术”（tSMS)。 vtSMS技术开始制备DNA文库，通过DNA剪切和 加入poli（A）尾部生成的DNA片段（Ozsolak

13、等 2010），然后与流通池内poli（T）的寡核苷酸的 DNA片段杂交，同时再平行反应测序。 SMRT 测序仪测序仪 vSMRT测序仪的原理即通过由成千上万零级波导测序仪的原理即通过由成千上万零级波导 组成的测序芯片上合成方法进行单分子实时测序组成的测序芯片上合成方法进行单分子实时测序 (ZMWs)。DNA片段的测序反应由单个片段的测序反应由单个DNA聚合聚合 酶分子参与，该酶位于每个零模波导的底部，以酶分子参与，该酶位于每个零模波导的底部，以 至于每个至于每个DNA聚合酶都存在于零级波导的可检测聚合酶都存在于零级波导的可检测 区区(Fig. 2)。 单分子实时测序仪单分子实时测序仪(RNA

14、P) v不同的单分子不同的单分子DNA测序方法测序方法,即即RNA聚合酶聚合酶(RNAP), 已经被提出（已经被提出（Greenleaf and Block 2006）该方法中）该方法中 RNA聚合酶被连接到一个聚苯乙烯珠，而聚合酶被连接到一个聚苯乙烯珠，而DNA片段片段 的末端被连接到另一个珠。每个珠被放在光陷阱和一的末端被连接到另一个珠。每个珠被放在光陷阱和一 对光陷阱悬浮珠。对光陷阱悬浮珠。RNA聚合酶和聚合酶和DNA片段相互作用片段相互作用 ，转录沿着模板进行，改变两个珠子间，转录沿着模板进行，改变两个珠子间DNA的长度。的长度。 这导致两个珠子间的位移可以在埃的精度范围内进行这导致两

15、个珠子间的位移可以在埃的精度范围内进行 标注，从而导致单碱基分辨率在单分子标注，从而导致单碱基分辨率在单分子DNA水平上。水平上。 通过调整四个位移的记录，四种核苷酸之中每一个具通过调整四个位移的记录，四种核苷酸之中每一个具 有较低浓度的一种，类似于用桑格测序中的引物和校有较低浓度的一种，类似于用桑格测序中的引物和校 准使用已知序列的侧翼序列的未知片段，有可能推断准使用已知序列的侧翼序列的未知片段，有可能推断 出序列信息。出序列信息。 纳米孔纳米孔DNA测序仪测序仪 v这项技术是由研究通过各种人造纳米孔的这项技术是由研究通过各种人造纳米孔的DNA的的 易位发展而来的。用纳米孔的易位发展而来的。

16、用纳米孔的DNA测序仪依赖于测序仪依赖于 通过一个纳米孔核苷酸电信号的转换，这是一个通过一个纳米孔核苷酸电信号的转换，这是一个- 溶血素孔隙用环糊精分子共价连接于核苷酸的结溶血素孔隙用环糊精分子共价连接于核苷酸的结 合位点合位点。这项技术的原理是基于当一个。这项技术的原理是基于当一个DNA分子分子 穿过纳米孔时离子电流的调制，从而揭示分子的穿过纳米孔时离子电流的调制，从而揭示分子的 特征和参数（直径，长度和构象）（图特征和参数（直径，长度和构象）（图2）。在测）。在测 序过程中离子电流通过被核苷酸堵塞的纳米孔径序过程中离子电流通过被核苷酸堵塞的纳米孔径 ，即，先前被核酸外切酶从与环糊精相互作用

17、的，即，先前被核酸外切酶从与环糊精相互作用的 DNA链裂解的。当前块这一时期对于每一个碱基链裂解的。当前块这一时期对于每一个碱基 和和DNA序列的确定是特有的序列的确定是特有的(Astier etal. 2006; Rusk 2009)。 实时单分子实时单分子DNA测序平台测序平台 VisiGen生物技术开发生物技术开发 vVisiGen生物技术生物技术()介绍了介绍了 一个特制的一个特制的DNA聚合酶聚合酶,它对于改性的核苷酸而言它对于改性的核苷酸而言 相当于一个带有供体荧光染料的相当于一个带有供体荧光染料的实时传感器实时传感器， 当掺入合成时核苷酸与聚合酶活性位点结合当掺入合成时核苷酸与聚

18、合酶活性位点结合 (图图2) 。所有参与合成的四种核苷酸被修改，每一个都。所有参与合成的四种核苷酸被修改，每一个都 有不同的受体染料。在合成时有不同的受体染料。在合成时,当正确的核苷酸被当正确的核苷酸被 发现发现,它被选择并进入酶的活性部位它被选择并进入酶的活性部位,供体染料标供体染料标 记的聚合酶密切接近带有受体染料的核苷酸，能记的聚合酶密切接近带有受体染料的核苷酸，能 量被从供体传递到受体染料产生升高的荧光共振量被从供体传递到受体染料产生升高的荧光共振 能量转移能量转移(FRET)光信号光信号(Selvin 2000)。 多重聚合酶技术多重聚合酶技术 v在这种技术中在这种技术中,几百个测序

19、模板放置在薄层琼脂糖几百个测序模板放置在薄层琼脂糖 面板上，序列被平行确定。这方法显示增加几个面板上，序列被平行确定。这方法显示增加几个 数量级的样本数量数量级的样本数量,可以同时分析。它可以同时分析。它的的优势优势是是大大 量减少反应体积量减少反应体积,需要较少量的试剂和由此产生的需要较少量的试剂和由此产生的 成本更低。成本更低。 v随着试剂体积的显著减少随着试剂体积的显著减少,单位体积成本低单位体积成本低10倍倍, 该公司希望很快达到目标为每个基因组该公司希望很快达到目标为每个基因组1000美元美元 。 离子流测序技术离子流测序技术 v在最新的进展，第一在最新的进展，第一PostLight

20、TM测序技术（离子流测序技术（离子流 ）已经被介绍）已经被介绍(http:/ 技术创建了一个在化学和数字信息间的直接连接技术创建了一个在化学和数字信息间的直接连接,支支 持快速、简单、可大规模扩展的测序。它利用简单的持快速、简单、可大规模扩展的测序。它利用简单的 核酸沃森化学令人难以置信的强大的、专有的半导体核酸沃森化学令人难以置信的强大的、专有的半导体 技术技术摩尔定律摩尔定律(Moore 1965)。离子流原理半导体。离子流原理半导体 技术是基于一个良好特征的生化过程，其中一个核苷技术是基于一个良好特征的生化过程，其中一个核苷 酸通过聚合酶酸通过聚合酶掺掺入一入一条条DNA链链, 导致释放

21、氢离子作为导致释放氢离子作为 一种副产品一种副产品(图图2)。例如。例如,如果核苷酸如果核苷酸A是添加到是添加到DNA 模板并掺入到一条模板并掺入到一条DNA链，然后一个氢离子将被释放链，然后一个氢离子将被释放 。离子电荷会改变溶液的。离子电荷会改变溶液的pH值值,可以直接由没有扫描可以直接由没有扫描 、相机和光、相机和光学设备学设备的离子传感器检测到。的离子传感器检测到。 2021-7-26 第二代和第三代第二代和第三代HT-NGS平台的平台的比比较较 vthe third HT-NGS technologies may offer the following advantages over

22、 second HT-NGS technologies: i) higher throughput, ii) faster turnaround time (e.g., sequencing metazoan genomes at high fold coverage in minutes), iii) longer read lengths to enhance de novo assembly and enable direct detection of haplotypes and even whole chromosome phasing, iv) higher consensus a

23、ccuracy to enable rare variant detection, v) small amounts of starting material (theoretically only a single molecule may be required for sequencing), vi) low cost, wheresequencing the human genome at high fold coverage for less than $1000 is now a reasonable goal for the community. 2021-7-26 v自自200

24、1年以来年以来,当以毛细管电泳荧光标记的个体桑当以毛细管电泳荧光标记的个体桑 格测序方法为基础的人类基因组测序技术的出现格测序方法为基础的人类基因组测序技术的出现, 下一代测序平台的出现急剧增加了获得下一代测序平台的出现急剧增加了获得DNA序列序列 的速度的速度,而成本比他们的前辈降低了几个数量级而成本比他们的前辈降低了几个数量级 ( 图图3)。这是因为数据生成的基本机制已经发生了。这是因为数据生成的基本机制已经发生了 根本性的变化根本性的变化,产生更多序列读取产生更多序列读取/仪器运行和显仪器运行和显 著降低费用。图著降低费用。图3说明了说明了HT-NGS信息如何产生既信息如何产生既 增强我

25、们的知识又扩大了基因组在生物医学研究增强我们的知识又扩大了基因组在生物医学研究 的影响的结果的影响的结果(Mardis 2011)。 2021-7-26 人类基因组研究领域中测序技术人类基因组研究领域中测序技术 的应用和进展的应用和进展 v人类基因测序的里程碑通过两个团队实现，即，人类基因测序的里程碑通过两个团队实现，即， 公开资助的人类基因组团队（公开资助的人类基因组团队（HGP）和塞雷拉团）和塞雷拉团 队，两个团队采取不同的策略。队，两个团队采取不同的策略。HGP通过一个染通过一个染 色体图的策略，起草了一个人类基因组的工作草色体图的策略，起草了一个人类基因组的工作草 稿，然而，塞雷拉公司

26、，利用对全基因组打靶（稿，然而，塞雷拉公司，利用对全基因组打靶（ Fig4）的途径对人类基因组进行测序。）的途径对人类基因组进行测序。 v自从自从2005年运用高通量下一代测序平台，利用它年运用高通量下一代测序平台，利用它 可以大量而又低成本的特点进行有效的测序，特可以大量而又低成本的特点进行有效的测序，特 别应用在人类基因组研究，重新合成基因序列，别应用在人类基因组研究，重新合成基因序列， 全基因组测序或更有针对性的测序，转录物组，全基因组测序或更有针对性的测序，转录物组， 细胞组织和有机体细胞组织和有机体(转录测序转录测序),基因组的变异和突基因组的变异和突 变检测，外基因标记和染色体结构

27、的全基因分析变检测，外基因标记和染色体结构的全基因分析 ，DNA序列和基因序列序列和基因序列(染色质免疫沉淀反应耦合染色质免疫沉淀反应耦合 到到DNA基因技术基因技术)和个人基因序列和个人基因序列(表表2) De Novo, resequencing and targeted sequencing v一般来说，利用高通量新一代测序技术对包括人一般来说，利用高通量新一代测序技术对包括人 类在内的大多数生物的短序列组装是一项既耗时类在内的大多数生物的短序列组装是一项既耗时 花费又很大的工作。花费又很大的工作。 RNA sequencing v高通量新一代测序也可以用于小高通量新一代测序也可以用于小

28、RNA序列的研究序列的研究 。 vRNA的测序被用来更精确的控制特殊基因的表达的测序被用来更精确的控制特殊基因的表达 已决定不同的剪接，转录的特性表达和用于已决定不同的剪接，转录的特性表达和用于RNA 测序试验的许多与生物有关的问题测序试验的许多与生物有关的问题(Costa et al.2010b)。 Epigenetics v高通量新一代测序技术提供了一个大幅度增加表高通量新一代测序技术提供了一个大幅度增加表 观研究的可能（可遗传的基因调控的研究，这个观研究的可能（可遗传的基因调控的研究，这个 研究不包含研究不包含DNA测序但包括测序但包括DNA的修饰及其高级的修饰及其高级 结构），包括组蛋

29、白的转录后修饰，转录因子和结构），包括组蛋白的转录后修饰，转录因子和 靶序列的相互作用，全基因组规模上核小体的定靶序列的相互作用，全基因组规模上核小体的定 位以及位以及DNA甲基化模型的特点（甲基化模型的特点（Bormann et al 2010；Fouse et al .2010；Bhaijee et al 2011） 。 基因变异和突变检测基因变异和突变检测 v新一代测序技术允许通过在人群中揭露所有常见新一代测序技术允许通过在人群中揭露所有常见 和罕见的遗传变异（鲍恩等人，和罕见的遗传变异（鲍恩等人，2011），以方便），以方便 全基因组人口结构变化的研究（西等人，全基因组人口结构变化的研

30、究（西等人，2010； 海恩等人，海恩等人，2010）。事实上，）。事实上，“千人基因组计划千人基因组计划” 正朝着这个目标努力，已经取得了很大的进展（正朝着这个目标努力，已经取得了很大的进展（ 德宾等人，德宾等人，2010）。研究人员通过新一代测序技）。研究人员通过新一代测序技 术制作一个所有人类变异的全面的遗传图谱，将术制作一个所有人类变异的全面的遗传图谱，将 能够进行更详细的实验，来检测潜在的遗传变异能够进行更详细的实验，来检测潜在的遗传变异 对药物的反应。对药物的反应。 癌症研究和生物标志物癌症研究和生物标志物 v高通量下一代测序技术的进步也推动新的诊断和高通量下一代测序技术的进步也推

31、动新的诊断和 治疗癌症的治疗方法的发展（梅尔森等，治疗癌症的治疗方法的发展（梅尔森等，2010） ，还推动了研究人员重新排序的肿瘤和正常基因，还推动了研究人员重新排序的肿瘤和正常基因 组比较特定类型的癌症（普法伊费尔和埃诺组比较特定类型的癌症（普法伊费尔和埃诺 2011 ）的发展。在癌症的基因组中，它能够快速识别）的发展。在癌症的基因组中，它能够快速识别 病人的具体的固体肿瘤（丁等人，病人的具体的固体肿瘤（丁等人，2010；麦克布；麦克布 莱德等人，莱德等人，2010）的重排。）的重排。 动物基因组研究测序技术的应用与进展动物基因组研究测序技术的应用与进展 v在上下文中的高通量下一代测序技术的影响方面，讨在上下文中的高通量下一代测序技术的影响方面，讨 论有关重要的经济农场动物也是本出版物的范围。这论有关重要的经济农场动物也是本出版物的范围。这 些组装动物的基因组中的重要的特征总结于表些组装动物的基因组中的重要的特征总结于表