基因组编辑技术专题

基因组编辑技术专题1整理课件自从证明DNA是遗传物质以后，人类就开始了通过改变DNA来改造生物体生理机理和功能的尝试。1973年，斯坦利·N·科恩(StanleyN.Cohen)和赫伯特·W·博耶(HerbertW.Boyer)成功将蛙的DNA插入到细菌中。

20世纪70年代，基因泰克(Genetech)公司对大肠杆菌进行基因改造，使其带有一个人源基因(这个基因是人工合成的)，最后生产出治疗糖尿病的胰岛素。

1974年，，加利福尼亚州索克生物研究所(SalkInstituteforBiologicalStudies)的RudolfJaenisch通过将SV40病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中,培育出了第一只转基因小鼠。2整理课件基因突变技术：物理诱变、化学诱变…转基因技术：T-DNA插入RNA干扰技术：dsRNA、ArtificialmiRNA核外遗传技术：质粒、人工染色体同源重组技术：e.g.传统的基因敲除小鼠无法控制突变位点不能精确控制外源基因插入位点对靶基因抑制不彻底、不特异难以稳定的遗传费时费力费钱，难以大量应用并引起一系列生物伦理的问题…现状3整理课件4整理课件基因组编辑技术基因组编辑技术（genomeediting）是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。也称为基因打靶（Genetargeting）。技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。5整理课件历史1993年前ZFN就已开始出现，迄今已发展了20多年才有今天的成就；2009年底出现的TALEN似乎一夜之间呈现出取代ZFN的架势；2012年底CRISPR/Cas已显现出取代TALEN的巨大潜力，在2013年成为现实。荣誉2011年：ZFN，

TALEN和Meganuclease—2011年度方法（NatureMethods）2012年：TALEN—2012年十大突破（Science）2013年：CRISPR/Cas被认为是诺贝尔奖级别的成果，华人科学家张峰已因此获得生物医学大奖。基因组编辑技术应用基因组巡航导弹，分子剪刀，DNA外科医生定点突变，定点修饰（包括得到转基因），转录调控基因治疗（如遗传病）6整理课件基因编辑的三大利器ZFN

(Zinc-fingernucleases,ZFN)TALEN（transcriptionactivator-likeeffectornucleases)CRISPR/Cas(clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat/Cas-basedRNA-guidedDNAendonucleases）特异性DNA识别域非特异性核酸内切酶+7整理课件ZFN原理ZFN=蛋白的DNA识别域+核酸内切酶DNA识别域：由一系列Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般3~4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。8整理课件核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA

两条ZFN之间具有被称为“间隔区”的spacer结构，该结构的长度以5～6bp为宜，7bp也能正常工作，合理的“间隔区”设计才能保证ZFN二聚体拥有最佳的工作空间。9整理课件ZFN技术的缺陷DNA识别域虽然具有较强的特异性识别能力，但是其识别的序列长度比较有限。因为ZFN剪切的过程不完全依赖同源二聚体的形成，所以一旦形成异源二聚体，就很可能造成脱靶效应；如果出现脱靶，可能导致DNA的错配和序列改变，产生较强的细胞毒性。当这些不良影响积累过多，超过细胞修复机制承受的范围时，便会引起细胞的凋亡。另一方面，该手段在细胞内部操作的精确程度不足，则可能会引起相关基因突变，引发癌症等。ZFN作为基因治疗的手段之一，如果在生物体内使用，可能会引发免疫反应。而现有的研究手段尚不能预测引入的ZNF蛋白是否会引起免疫系统的进攻。到目前为止，ZFN技术只能用于体外操作（invitro），在对人体提取的细胞进行处理之后，再导入回输到病人体内。10整理课件TALENTALE（Transcriptionactivator-likeeffectors）:一种源于植物致病菌的靶向基因操作技术。科学家发现，来自植物细菌Xanthomonassp.(黄单胞菌)的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源基因的表达调控。目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。11整理课件TALEN原理典型的TALEN由一个包含核定位信号（NLS）的N端结构域、一个包含可识别特定DNA序列的典型串联TALE重复序列的中央结构域，以及一个具有FokI核酸内切酶功能的C端结构域组成。DNA识别域：由一系列TAL蛋白串联组成（一般20个左右），每个TAL蛋白识别并结合一个对应的碱基。核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA12整理课件全长为34aa的Tal蛋白的第12、13位氨基残基可以特异性识别核苷酸碱基。

NG可以识别THD可以识别CNI可以识别ANN可以识别G或A通过这种特异性识别，将多个Tal蛋白组装在一起，就可以构成可以识别目的片段的Tale蛋白。TALEN原理13整理课件TALEN的特异性打靶的原理：一对可以特异性识别靶基因的TALE，定位到需要编辑的基因组区域；然后非特异性核酸内切酶FokI切断双链DNA从而造成DNA双链断裂（double-strandbreak，DSB）；再通过DNA的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。FokI只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性。TALEN原理14整理课件构建特异性的TALEN表达载体15整理课件TALEN介导的基因编辑TALEN质粒对共转入细胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个TALEN融合蛋白中的FokI临近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA。形成DSB时，同源重组可将需要敲入的序列组合入基因组。16整理课件TALEN元件的优化17整理课件TALEN的技术特点任意敲除，无基因序列、细胞、物种限制，永久失活成功率高，在保证转染效率的前提下，有效性可达95%以上打靶效率高，可完全替代RNAi技术脱靶率低，尚未发现明显脱靶效应技术简单，只需按照常规构建质粒方法构建Talen质粒18整理课件19整理课件Fightinginvasion.Whenviruses(green)attackbacteria,thebacteriarespondwithDNA-targetingdefensesthatbiologistshavelearnedtoexploitforgeneticengineering.20整理课件Invasion.Streptococcusthermophilus(嗜热链球菌)suchasthisonemayacquirekeydefensivesequencefrominfectiousbacteriophage,attachedattop.LactoseLacticacid发现21整理课件CRISPR-Cas主要由两部分组成：1CRISPR-Cas系统的发现CRISPR（成簇、规律间隔的短回文重复序列）-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然存在免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别的一种获得性免疫机制。识别切割22整理课件埃马纽埃尔·卡彭蒂耶EmmanuelleCharpentier珍妮弗·杜德娜JenniferDoudnaBreakthroughPrizeinLifeSciences23整理课件1CRISPR-Cas系统的发现免疫过程24整理课件1CRISPR-Cas系统的发现CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫,而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，细菌进化了CRISPR介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。25整理课件CRISPR/Cas系统分类：根据CRISPR—Cas系统中的Cas蛋白的种类和同源性，可将CRISPR—Cas系统区分成3种类型：TYPEITYPEIITYPEIII1CRISPR-Cas系统的发现26整理课件2Type

II

CRISPR系统—Cas9随着越来越多的不同菌中的CRISPR系统被发现，研究者们根据他们降解外源的遗传物质的方法，将他们分为了三类。

Type

I

and

Type

III.

这两套系统由于参与的蛋白众多，需要几个复合物共同作用才能发挥作用，使得它不宜操作和改造。27整理课件PAM:proto-spaceradjacentmotifs(保守的间隔相邻基序)crRNA:CRISPRRNAtracrRNA:trans-activatingCRISPRRNA3.人工改造

Type

II

CRISPR系统中的Cas9是个核酸酶，这个核酸酶结合两个RNA(crRNA,

tracrRNA)就可以切割双链DNA.

28整理课件3.人工改造

他们进一步阐明了RNA和目标DNA配对的原则，同时将crRNA-tracrRNA连接成了chimera

RNA，这样只需要Cas9蛋白和一条定制的RNA就可以编辑特性的DNA。2012年Jennifer

A.

Doudna和Emmanuelle

Charpentier的这篇Science发现了一个比较简单的CRISPR（TypeII）系统的机理。这一系统就简单多了，一个巨大的160KD的蛋白Cas9利用RNA,

就可以完成识别和切割靶向的DNA。29整理课件3.人工改造他们进一步分析了Cas9作为核酸酶的活性位点：两个核酸酶活性域会分别切割靶DNA的两条链，造成双链断裂。30整理课件Nucl.AcidsRes.-2013-DiCarlo-nar_gkt135Cas9gRNA20nt4.工作原理Cas9蛋白与向导RNA结合、组装的动作是这套位点特异性的基因组修饰过程里的限速步骤。31整理课件真核系统的应用1）

优化密码子，让Cas9蛋白可以在哺乳动物系统中很好的表达。

2）

加了核定位序列(NLS)，这样可以把Cas9送到细胞核内进行基因组编辑。

3）

当然，同时需要表达一个guide

RNA，把Cas9定位到靶DNA处。

4）

CRISPR-Cas系统靶向要求为PAM序列（5’-NGG-3’），即靶序列后面必须为NGG才能被向导RNA识别，在人类基因组中平均每8个碱基就可以出现一个NGG。利用这个技术，就可以很方便高效廉价地在细胞上做基因编辑：包括敲除、修改、插入。4.工作原理32整理课件4.工作原理-切割后的处理NHEJ

:Non-homologousendjoining非同源性末端接合HDR:Homology-directrepair同源直接修复33整理课件进一步用Nickase增加编辑特异性因为Cas9介导的靶向主要依赖于guide

RNA和目标DNA20左右的碱基的配对，大家开始重视脱靶效应（off-target）。ZhangFengMIT&PKU很快，MIT的张峰在Cell上发表了Double

Nick的方法。Cas9会在目标DNA上切两刀，如果把其中一个核酸酶活性位点突变掉，它就变成了一个切口酶。用两对这样的sgRNA把这种切口酶带到基因组上的特异位点，这样就大大提高了靶向的特异性。4.工作原理34整理课件4.工作原理35整理课件CRISPR/Cas9的特点和优势操作简单，靶向精确性更高。sgRNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配，Cas9才会对DNA进行剪切。编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZENs更简单方便，用于CRISPR的sgRNA识别序列仅需20个核苷酸。CRISPR/Cas9系统是由RNA调控的对DNA的修饰，其基因修饰可遗传。基因修饰率高，基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等可实现对靶基因多个位点同时敲除。无物种限制。实验周期短，最快仅需2个月，节省大量时间和成本。3636整理课件CRISPR技术存在问题和解决方案目前不清楚向导RNA分子的特异性作用机脱靶效应（off-targeteffect）。Joung的工作显示，与向导RNA序列类似的非靶点DNA片段也能够被切断、激活或者失活，即存在明显的脱靶效应。新方法解决CRISPR-Cas系统难点可减弱甚至消除消除脱靶效应

利用计算机模型。调整导向RNA序列的量计算高目标效应和低脱靶效应间最优平衡点最新研究表明，增长RNA链可以提高RNA的结合效率。所以张峰教授对RNA片段结构进行优化，包含一段稳定的发卡结构，能更有效的引导Cas9发挥作用37整理课件1）基因敲除：如果想使某个基因的功能丧失，可以在这个基因上产生DSB，NHEJ修复的过程中往往会产生DNA的插入或删除（indel），造成移码突变，从而实现基因敲除。2）特异突变引入：如果想把某个特异的突变引入到基因组上，需要通过同源重组来实现，这时候要提供一个含有特异突变同源模版。正常情况下同源重组效率非常低，而在这个位点产生DSB会极大的提高重组效率，从而实现特异突变的引入。3）定点转基因：与特异突变引入的原理一样，在同源模版中间加入一个转基因，这个转基因在DSB修复过程中会被拷贝到基因组中，从而实现定点转基因。通过定点转基因的方法可以把基因插入到人的基因组AAVS1位点，这个位点是一个开放位点，支持转基因长期稳定的表达，破坏这个位点对细胞没有不良影响，因此被广泛利用。应用（理论上）38整理课件应用（理论上）转录抑制或转录激活特异性的干扰表观遗传学调控在活细胞中成像DNA位点RNA的操作人体基因治疗生态工程分子生物学工具开发构建突变体库遗传筛选基因组编辑技术改良39整理课件ElizabethPennisi.

TheCRISPRCraze.Science23August2013;DOI:

10.1126/science.341.6148.833基因组编辑（基于DSB）NHEJHDR基因干扰基因激活原理设想一下：一个人（Cas9）拿着一把钥匙（gRNA）去开一栋大楼中的某个房间。40整理课件应用—水稻Indel(33%)NatureProtocols

doi:10.1038/nprot.2014.15741整理课件测序分析转基因株系3个靶位点突变（体细胞突变形成嵌合体）：应用—拟南芥42整理课件SchematicDiagramofAssemblingCas9/sgRNAConstructandSelectingTargetSitesinPDS1AgrobacteriumWeconstructplasmids

thatcarrying4/3/2/1sgRNAstargetingPtPDS1gene,respectively.应用—杨树43整理课件应用—杨树44整理课件TheBigFragmentChangesattheDesignedCas9TargetingSitesinPtPDSGeneAbigfragmentinversionmutantofPtPDS1AbigfragmentdeletionmutantofPtPDS1应用—杨树45整理课件应用—果蝇A.Bassett,J.-L.Liu/Methods69(2014)128–136HRMA:High-resolutionmeltinganalysis(高分辨率熔解曲线分析)46整理课件A.Ba