大肠杆菌（Escherichia coli）

1、 小组成员 分工 包 升 制作PPT 冯 宇 讲解PPT 李春雷 查找并整理第一部分资料 刘 磊 查找并整理第一、五部分资料 王 鹏 查找并整理第二、三部分资料 熊志江 查找并整理第四部分资料 大肠杆菌（Escherichia coli） 第二部分 遗传物质 第三部分 基因突变及修复 目录 第四部分 基因转移及重组 第五部分 研究应用 第一部分 概述 概述 一、形态特征： 大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢的直杆 菌，大小约0.4-0.7m2.0-3.0m，两 端钝圆，多单独存在或成双，但不呈 长链状排列。大多数菌株具有周生鞭 毛而能运动，有的菌株具有荚膜或微 荚膜，不形成芽胞，对普通碱性染料 着色良

2、好。 二、培养特性： 大肠杆菌为兼性 厌氧菌，在普通 培养基上生长良 好，最适生长温 度37，最适生 长pH7.2-7.4 大肠杆菌与沙门氏菌在鉴别培养基上的菌落特征 细菌 培养基 麦康凯 培养基 伊红美蓝 培养基 SS培养基 三糖铁琼 脂斜面 大肠杆菌红色 紫黑色带金 属光泽 红色 斜面黄色，底层 变黄有气泡，不 产生H2S 沙门氏菌淡桔红色 较小无色透 明 淡红色、半透 明，产H2S菌 株菌落中心有 黑点 斜面红色、底层 变黄、有气泡、 部分菌株产H2S 伊红美蓝培养基上产生黑 色带金属闪光的菌落 2 电镜下的大肠杆菌 大肠杆菌与沙门氏菌生化试验鉴别表 实验类别 葡萄糖乳糖麦芽糖 甘露醇

3、蔗糖 吲哚试验 （IDN） MR 试验 VP 试验 枸橘酸盐 （CIT） H2S 动力 (MOT) 大肠杆菌 /-V+-+ 沙门氏菌-+/-+/- 注： ：产酸产气；+：阳性；-：阴性；+/-：大多数菌株阳性/少数阴性；V：种间有不同反应。 三、生化特性： 普通营养琼脂 上生长24h后， 形成圆形凸起、 光滑、湿润、 半透明、灰白 色、中等大小 菌落。 微生物资源数据库共享平台 菌株保藏编号 NKCCMR NK 7.C 7037 大肠杆菌在麦康凯培养基上长成红色菌落 概述3 致病性大肠杆菌 肠道致病性大肠 杆菌 含粘附素和肠毒素等、 可分泌具有细胞毒性 的（类）志贺毒素 主要引起非炎症性腹 泻

4、、出血性肠炎、溶 血性尿毒综合征等 肠道外致病性大 肠杆菌 主要引致败血症 以及尿道、生殖 道、乳腺等感染 四、致病性： 五、微生物诊断： 从可疑症状着手分析，再采集病变组织或者收集粪便或肠内容物，划线接种于麦康 凯或伊红美蓝琼脂平板上，挑取可疑菌落同时接种于TSI琼脂和普通琼脂斜面，然 后革兰氏染色、镜检形态，淘汰不符合者，最后做生化试验；也可用多重PCR法检 测细菌的特异性基因。 概述4 5 E.coli基因组中还包含有许多插入序列，这些插入的片段都是由基因的水平转移和基 因重组而形成的。利用大肠杆菌基因组的这种特性对其进行改造，使其中的某些基 因发生突变或缺失，从而给大肠杆菌带来可以观察

5、到的变化，这种能观察到的特征 叫做大肠杆菌的表现型 (Phenotype)，把引起这种变化的基因构成叫做大肠杆菌的基 因型(Genotype)。具有不同基因型的菌株表现出不同的特性。 大肠杆菌环状遗传图 一、基因组： 大肠杆菌(Escherichia coli， E.coli)染色体基因组是研究最清 楚的基因组。 大肠杆菌K12基因组大小为4.6 106bp，共有4288个基因，基 因的平均长度是951bp。 大肠杆菌染色体基因组中，大 多数rRNA基因集中于基因组的 复制起点oriC的位置附近。 遗传物质 遗传物质6 与基因重组相关的基因型recA、recB、recC等 与甲基化相关的基因型

6、dam、dcm、mcrA、mcrB和C、mrr、hsdM等 与点突变相关的基因型mutS、mutT、dut、ung、uvrB等 与核酸内切酶相关的基因型hsdR、hsdS、endA等 与终止密码子相关的基因型supE、supF等 与抗药性相关的基因型gyrA、rpsL、Tn5、Tn10等 与能量代谢相关的基因型lacZ、lacZ M15、lacl q、ara、mtl、xyl、gal、srl等 与氨基酸代谢相关的基因型gpt、thyA、asd、leuB、proA、proB、trpR、lys、metB、cysB、thr等 与维生素代谢等相关的基因型bioH、thi等 与蛋白酶相关的基因型Lon、o

7、mpT等 与物质转运结合相关的基因型tonA=fhuA、tsx、cysA等 其他deoR、traD、hflC、minA、B、relA、glnV、tyrT等 二、主要基因型： 主要的基因型说明 1、基因重组相关的基因型 recA (Recombination) 功能：recA基因表达 ATP依赖型 DNA重组酶，它在-噬菌体与基因组 DNA的溶原重组时起作 用，同时具有对 DNA放射性损伤的修复功能。由 recA基因的变异所产生的基因型使同源或异源 DNA的 重组不能进行，保持插入DNA的稳定性，对 DNA的转化有利。一个菌株的基因型如果是 recA,则说明此 菌株的表现型是重组缺陷的。 遗传物

8、质7 染色体的结构 电镜观察大肠杆菌的染色体，可见是一团具有许多环状螺旋结构的DNA大分子，中 央有一骨架，其周围附着有30-50个超螺旋的环，环的长度约为20nm，每个DNA环 中的DNA都是负超螺旋。 DNA的复制 大肠杆菌的染色体复制需要DNA聚合酶、引物酶及其他与复制有关的蛋白质。 复制起点是oriC位于大肠杆菌遗传图84.3min处。 DNA按型方式进行双向等速复制，分为起始、延伸和终止三个阶段。 三、染色体： 8基因突变及修复 在基因突变研究中，大肠杆菌、沙门菌等一直是研究的极佳材料，因为它们只有一 条染色体，其遗传物质的改变而导致的表型可立即表现出来。 大肠杆菌中还存在修复系统，

9、可以恢复不同的DNA损伤。 突变类型： 自发突变：自然条件下产生的突变。在进行DNA自我复制时，在基因突变与基因修 复的共同作用下发生突变。 适应突变：在非致死条件下，延长培养时间细胞发生的一种使自身适应环境的自发 突变。 诱变：人为选择某些可强烈地影响DNA结构的诱变剂处理引发的突变。 一、基因突变： 大肠杆菌的Uvr修复系统 大肠杆菌的UvrABC核酸内切酶能对损伤的DNA进行识别和切割。 uvrA、uvrB、uvrC基因共同编码UvrABC核酸内切酶。 二、DNA修复： 9 基因基因产物的功能 uvrADNA结合蛋白 uvrB与uvrA结合后再与DNA结合成复合体，在损伤DNA的3末端造

10、成缺口 uvrC与uvrB结合成复合体，在损伤DNA的5末端造成缺口 uvrD帮助移去含有损伤的寡核苷酸 DNA聚合酶I填充单链缺口 连接酶封合单链缺口 大肠杆菌的SOS修复系统 细胞损伤时，参与DNA修复的基因，包括切除修复基因（uvrA、uvrB、uvrC）、重 组修复基因（recA）及其他基因（umuC、umuD）。 OS修复主要通过增加切除修复酶和重组修复酶的含量，来增强对损伤DNA的修复。 正常细胞中， LexA阻遏蛋白与lexA、recA、uvrA、uvrB、uvrC基因的操纵区结合， 阻遏它们表达，只合成少量RecA蛋白和修复酶，修复零星的DNA损伤。大肠杆菌受 到UV照射后，产

11、生大量二聚体，出现大量单链DNA部位，与细胞内少量RecA蛋白 结合，激活其蛋白酶功能，使LexA阻遏蛋白自我切割，并且促进DNA同源配对。 基因突变及修复 大肠杆菌甲基化介导的错配修复系统 特异性不强，基本能修复DNA双链结构中任何轻微的损伤，包括错配、移码、 碱基类似物的替代等。 基因突变及修复10 大肠杆菌错配修复机制模式 步骤： 组成：MutS、MutL、MutH、 dam基因、UvrD、核酸外切酶 （ExoI、Exo 、RecJ和Exo）、 单链结合蛋白（SSB）、DNA聚合 酶、DNA链接酶。 dam基因编码Dam甲基化酶，使 GATC/CTAG序列中的A甲基化。 在这个修复系统中

12、，缺口是由 DNA聚合酶合成的，而其他大多 数修复反应都依靠DNA聚合酶 或 聚合酶。 11基因转移及重组 一、转化： 供体和受体质粒结果 F+F-2F+ HfrF-Hfr+F- F F-Hfr 供体细胞与受体细胞直接接触后，质粒从供体细胞向受体细胞转移的过程。 F质粒与接合作用 F+ : 细胞内含F质粒，以自 主复制形式存在； F- : 细胞内不含F质粒； F : 携带了宿主的一部分染 色体的F质粒； Hfr : F质粒通过同源重组整合到宿主的染色体上，随着宿主染 色体复制而复制。大肠杆菌的接合 二、接合： 12基因转移及重组 局限性转导： 被转导的DNA片段仅仅是靠近染色体溶源化位点的基因

13、。 噬菌体：只转导gal和bio基因。携带gal基因的转导噬菌体称为dgal或dg，携带 bio基因的转导噬菌体称为dbio或db。（d表示缺陷） 80噬菌体： 80整合部位靠近色氨酸基因（trp），可用 80dt转导噬菌体对基因 trp进行转导。 三、转导： 利用噬菌体为媒介，将供体菌的部分DNA转移到受体菌内的现象。 普遍性转导： 任何供体的染色体都可以转移到受体细胞。 大肠杆菌的P1普遍性转导噬菌体 其pac位点的特异性比其他噬菌体低，以“headful”包装机制进行包装，能有效包装 宿主DNA片段。P1噬菌体的宿主范围较广，能将大肠杆菌的DNA转导到其他许多G- 细菌中。 浸染 P1供

14、体 裂解 收集子代噬菌体 浸染 受 体 （缺陷型E.coli） 菌苔计数噬菌斑 （完全培养基） 选出重组子 （转导子） （基本培养基）转导频率计算： 13基因转移及重组 注：Holliday模型，是第一个被广泛接受的重组模型，它是通过要发生重组的2个DNA分子的2条单链在同一 部位断裂，断裂的游离末端彼此交换形成异源双链，然后2条杂合单链彼此连接形成Holliday连接体。 Holliday连接体是所有重组模型的核心。 过程分为四个阶段 起始阶段（RecBCD酶） RecBCD酶能以相当高的频率启动含有Chi( )位点的DNA重组。( 为顺式作用重组位点) 链侵入、同源配对和Holliday结

15、构的形成（RecA蛋白质） RecA酶结合于粘性末端的3端后，凝集，形成稳定的丝状复合物。并启动其结合的DNA 与双链DNA纵向配对，形成RecA-单链DNA-双链DNA三元复合物。随后双链DNA解旋， 单链DNA便与之进行同源区的配对，将双链DNA中的同源单链置换出来，自己与互补链 配对，形成D-环。 非同源区(异源双链)的扩展（RuvAB） RuvA和RuvB蛋白复合体在Holliday结构形成后促进分支迁移。 Holliday连接体的切割 ruvC编码的RuvC蛋白质能特异识别Holliday结构且在体外将Holliday的交叉结构切开。 四、同源重组： 14研究应用 大肠杆菌在生物技术中的应用：