2基因工程PPT学习教案

1、会计学1 2基因工程基因工程PPT课件课件 第1页/共77页 第2页/共77页 第3页/共77页 一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶(RE)(RE) 是一类由细菌产生的能专一识别双链是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特中的特 定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键 的核酸内切酶，的核酸内切酶， 简称简称限制酶限制酶或或切割酶切割酶。 根据根据限制酶的限制酶的作用特性，一般分为三类：作用特性，一般分为三类： 、和和型，型， 其中常用的是其中常用的是型限制酶型限制酶。 第4页/共77页 6 限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶的分类 特性型型型 限制和修

2、饰活性 单一功能单一功能双功能 识别与切 割位点 分别，随机切 割，相距较远 同一位点 相距5- 10bp 对基因工 程中意义 无用非常有用意义不大 第5页/共77页 限制酶（限制酶（型）识别及切割位点型）识别及切割位点 特异识别及切割特异识别及切割4 4 8 8个个bpbp长度且具有长度且具有回文序列回文序列的的 DNADNA片断，主要产生片断，主要产生3 3种缺口：种缺口： 5 5粘性末端粘性末端 3 3粘性末端粘性末端 平端或钝端平端或钝端 回文序列回文序列 是指该部位的核苷酸序列呈是指该部位的核苷酸序列呈180180O O旋转对称旋转对称; ; 粘性末端粘性末端 是指经内切酶特异切割后

3、产生的是指经内切酶特异切割后产生的5 5末端突出或末端突出或 3 3末端突出的碱基序列相互具有互补性末端突出的碱基序列相互具有互补性。 第6页/共77页 8 EcoR I Escherichia 属属 名名 Coli 种名种名 Ry13 株株 系系 编号编号 若种名头若种名头2 2个字母相同则其中一个可用种名的第个字母相同则其中一个可用种名的第 一和第三个字母。一和第三个字母。 限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名 第7页/共77页 -G -CTTAA 5 3 AATTC- G- 3 5 -G -CTTAA 5 3 AATTC- G- 3 5 + EcoR I 产生产生3-3-粘性末端

4、粘性末端 -CTGCA -G 5 3 G- ACGTC- 3 5 -CTGCA -G 5 3 G- ACGTC- + Pst I 3 5 第8页/共77页 5-CCC 3-GGG GGG-3 CCC-5 + Sma I 5-CCC 3-GGG GGG-3 CCC-5 其它特殊性质其它特殊性质 的的型限制酶型限制酶 同裂酶（同裂酶（异源同工酶异源同工酶） 同尾酶同尾酶 可变酶可变酶 第9页/共77页 第10页/共77页 5-TTT 3-AAA AAA-3 TTT-5 + Aha Dra 5-TTT 3-AAA AAA-3 TTT-5 第11页/共77页 G CCATG GTACC G GGTAC

5、C CCATGG GGTAC C C CATGG + Kpn I 5-G 3-CCATG GTACC-3 G-5 + Asp718 I 5- 3- -3 -5 5- 3- -3 -5 5- 3- -3 -5 第12页/共77页 G CCTAG GATCC G GATC CTAG GATC CTAG 5- 3- -3 -5 Mbo BamH Bgl 5- 3- -3 -5 5-A 3-T T-3 A-5 第13页/共77页 第14页/共77页 微生物名称微生物名称酶名称酶名称识别顺序识别顺序同裂酶同裂酶同尾酶同尾酶 Bacillus amyloliquefaciens H 解淀粉芽孢杆菌解淀粉芽

6、孢杆菌 BamHGGATCCBstBgl Mbo Bacillius globigil 球芽孢杆菌球芽孢杆菌 Bgl ACATCT Escherichia coli RY13 大肠杆菌大肠杆菌 EcoRGAATTC Haemophilus influenzae 流感嗜血菌流感嗜血菌 Hind AAGCTTHsu Providencia stuartii 164 普罗威登细菌普罗威登细菌 PstCTGCAGSalp Streptomyces albus Subspecies pathocidicus 白色链球菌白色链球菌 SalGTCGACAva Xho 第15页/共77页 17 2.反应系统因

7、素反应系统因素 （1）缓冲液（无菌、无污染） （2）金属离子 如：型酶需Mg2+，若以Mn2+代替Mg2+ （如Hind，ECORI）则特异性改变。 离子浓度不合适会抑制酶活。 （3）牛血清蛋白(BSA) BSA 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、 化学品导致的酶变性。过量BSA会引起电泳拖尾 限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件 第16页/共77页 第17页/共77页 第18页/共77页 第19页/共77页 * T * T* T* T M g 2 + D N a s e I 5 3 3 5 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 d A T P ,d C T P

8、 ,d G T P - 3 2 P d T T P E . c o li D N A P O L I 第20页/共77页 Klenow Klenow片段（片段（DNA pol.DNA pol.大片断）大片断） 第21页/共77页 聚合酶Klenow DNA -32PdNTP 双链DNA 粘端 5- 外切酶 变性 + 5 3 3 5 3 5 3 5 3 3 5 5 5 53 3 标记探针 标记末端 在在cDNAcDNA克隆中，克隆中， 用于第二股链用于第二股链 的合成；的合成； DNADNA序列分析。序列分析。 第22页/共77页 （PCRPCR）。）。 第23页/共77页 第24页/共77页

9、26 酶类别肽链5-3聚合活性RNAseH AMV62，000 94，000 + M-MLV84，000+ 第25页/共77页 第26页/共77页 DNADNA连接酶可以连接酶可以 催化带有粘性末端或平头末端的催化带有粘性末端或平头末端的 双链双链DNADNA中一条链的中一条链的3 3OHOH与另一条链的与另一条链的5 5POPO3 3H H2 2形形 成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的DNADNA长链长链 。 DNADNA连接酶的用途连接酶的用途 （1 1） 两个双链两个双链DNADNA片段连接起来片段连接起来 5- ACG AATTCGT-3 5-

10、 ACG AATTCGT-3 T T4 4DNADNA连接酶连接酶 5-ACGAATTCGT-35-ACGAATTCGT-3 3- TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-53- TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5 （2 2） 修补带有缺口的双链修补带有缺口的双链DNADNA分子分子 T4DNA连接连接酶酶 第27页/共77页 29 AATTC G G CTTAA AATTC G G CTTAA 5 5 5 5 (1) (2) AATTC G G CTTAA AATTC G G CTTAA 5 5 AATTC G G CTTAA 5 5 (a)分子间连接 (

11、b)分子内连接 (1) (2) A T GC TA T A G CTA T4连接酶 T4连接酶 第28页/共77页 第29页/共77页 作用作用 将标记或未标记的将标记或未标记的dNTPdNTP加到加到DNADNA的的3 3OHOH末端；也可催化末端；也可催化 载体分子或待克隆的载体分子或待克隆的DNADNA片断上加上互补的同聚尾，便于进一片断上加上互补的同聚尾，便于进一 步连接。步连接。 应用应用 探针标记探针标记 P32-.dGTP G32G32G32G 32 G32G32G32G32 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接 第

12、30页/共77页 工具酶工具酶 活性活性 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNA DNA T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶 催化催化DNA5DNA5- -磷酸与磷酸与3 3- -羟基羟基 形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键 DNADNA聚合酶聚合酶 以以DNADNA为模板合成为模板合成DNA DNA 逆转录酶逆转录酶 以以RNARNA为模板合成为模板合成DNA DNA 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除末端磷酸切除末端磷酸 T4T4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化核酸催化核酸5-5-羟基磷酸化羟基磷酸化 末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶 催化催化3-3-端

13、合成同聚体尾端合成同聚体尾 第31页/共77页 第32页/共77页 第33页/共77页 第34页/共77页 2. 2. 具有具有1 1个以上的遗传标志，个以上的遗传标志， 便于筛选便于筛选 3. 3. 具有多克隆位点具有多克隆位点 第35页/共77页 总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型松弛型”质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。 广泛应用的质粒：广泛应用的质粒： pBR32质粒、质粒、pUC系列等系列等 第36页/共77页 第37页/共77页 第38页/共77页 (

14、 (二二)噬菌体噬菌体 组成特点组成特点： 双链线状双链线状DNADNA分子，分子， 全长全长50kb50kb， 含含6565个基因，个基因， 在其分子两端各含有在其分子两端各含有 1212个碱基的互补单链，是个碱基的互补单链，是 天然的粘性末端，被称为天然的粘性末端，被称为 COSCOS位点。位点。 第39页/共77页 第40页/共77页 噬菌体两种生长途径（示意图）噬菌体两种生长途径（示意图） 第41页/共77页 第42页/共77页 T T T T A A A A 质粒 外源DNA分子 TTAATTAA AATT EcoR I EcoR I AATT DNADNA重组基本过程重组基本过程

15、第43页/共77页 T T T T A A A A ligase TTAATTAA AATT “退火” AATT 第44页/共77页 转化到宿主细胞中(如E. coli) 宿主细胞 染色体DNA 重组质粒 重组质粒 第45页/共77页 筛选含有重组质粒的菌株 宿主细胞 染色体DNA 重组质粒 含有外源DNA的“工程菌” 第46页/共77页 含有外源DNA的“工程菌” 繁殖/扩增 第47页/共77页 表 达 产 物 分 离 纯 化 表达产物分离纯化表达产物分离纯化 第48页/共77页 第49页/共77页 （一）制备基因组（一）制备基因组DNADNA（基因（基因文库）文库） 分离、纯化基因组分离、

16、纯化基因组DNADNA 条件：条件：温和，在温和，在EDTAEDTA或或SDSSDS等存在下等存在下 RERE 用蛋白酶用蛋白酶K K消化细胞、酚抽提消化细胞、酚抽提 大小不同酶切片段大小不同酶切片段 片段分离：片段分离：常用蔗糖梯度或电泳分离常用蔗糖梯度或电泳分离 分别与同样分别与同样RERE消化的载体连接消化的载体连接 常用噬菌体载体或质粒载体常用噬菌体载体或质粒载体 DNADNA连接酶连接。连接酶连接。 导入细胞导入细胞 进入宿主细胞内培养扩增。进入宿主细胞内培养扩增。 筛选鉴定筛选鉴定 用分子杂交、凝胶电泳用分子杂交、凝胶电泳 等方法鉴定。等方法鉴定。 第50页/共77页 （1 1）合

17、成）合成cDNAcDNA第一条链第一条链 反应体系只有反应体系只有mRNAmRNA、逆转录酶、逆转录酶、4 4种种dNTPdNTP、引物。、引物。 引物是与引物是与mRNA3mRNA3端端 polyApolyA互补的寡聚互补的寡聚dTdT（121218dT18dT片段）片段） （2 2）合成）合成cDNAcDNA第二条链第二条链 RNaseRNase去掉模板去掉模板mRNAmRNA （3 3）构建）构建cDNAcDNA文库文库 cDNAcDNA两端加接头或衔接头两端加接头或衔接头 接头接头是人工合成的双链寡核苷酸两端平头，含有限制酶切位点。是人工合成的双链寡核苷酸两端平头，含有限制酶切位点。

18、衔接头衔接头是另一种人工合成的双链寡核苷酸一端平头，另一端为粘性末端。是另一种人工合成的双链寡核苷酸一端平头，另一端为粘性末端。 cDNAcDNA与载体相连。与载体相连。 导入宿主细胞进行克隆，这些菌体内保存导入宿主细胞进行克隆，这些菌体内保存cDNAcDNA集合体便是集合体便是cDNAcDNA文库。文库。 第51页/共77页 （二）制备（二）制备cDNA （cDNA文库）文库） 分离目的基因分离目的基因 的的mRNAmRNA 逆转录生成逆转录生成cDNAcDNA单链单链 水解去除水解去除mRNAmRNA， 合成合成cDNAcDNA双链双链 水解回折处单链水解回折处单链 得到平端双链得到平端双

19、链cDNAcDNA 导入宿主细胞克隆导入宿主细胞克隆, ,构建构建cDNAcDNA文库文库 第52页/共77页 在模板在模板DNADNA、引物、引物、dNTPdNTP、TaqDNATaqDNA聚合酶等条件下，聚合酶等条件下， 体外经体外经9494变性、变性、5454退火及退火及7272延伸延伸3 3个步骤的反复多个步骤的反复多 次循环（次循环（2525 3030次次），扩增目的基因（见），扩增目的基因（见1818章）。章）。 （四）人工合成基因（四）人工合成基因 引用引用DNADNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用测序仪测出某一基因的碱基序列，或根

20、据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNADNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 一般先合成短片断一般先合成短片断DNADNA，然后再拼接成长片段。，然后再拼接成长片段。 第53页/共77页 二、二、 目的基因与载体的连接（目的基因与载体的连接（接接） （主要有以下（主要有以下4 4种连接方式）种连接方式） 1) 1) 粘性末端连接粘性末端连接 2 2） 平头末端连接平头末端连接 3 3） 人工接头法人工接头法 4 4） 同源多聚尾连接法同源多聚尾连接法 第54页/共77页 来。来。 第55页/共77页 （三）（三） 人工接头法人工接头法 合成连

21、接子合成连接子与与DNADNA平头末端连接平头末端连接限制酶切割限制酶切割, , 产生粘性末端产生粘性末端连接，构建重组连接，构建重组DNADNA。 第56页/共77页 （四）同源多聚尾连接法（四）同源多聚尾连接法 第57页/共77页 无性繁殖无性繁殖 体外重组后的体外重组后的DNADNA导入受体细胞，形成转化子。导入受体细胞，形成转化子。 然后随受体细胞生长、增殖，使重组然后随受体细胞生长、增殖，使重组DNADNA发生复制、发生复制、 扩增，这一过程称为无性繁殖。扩增，这一过程称为无性繁殖。 克隆克隆 从上述无性繁殖细胞中进一步筛选出含目的从上述无性繁殖细胞中进一步筛选出含目的DNADNA

22、的重组体分子即为无性繁殖系或克隆。的重组体分子即为无性繁殖系或克隆。 宿主细胞宿主细胞 进行无性繁殖时所采用的受体细胞进行无性繁殖时所采用的受体细胞. . 第58页/共77页 重组重组DNADNA导入宿主细胞的类型导入宿主细胞的类型 转化转化 以以质粒质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；作载体构建的重组体导入受体细胞的过程； 转染转染 以病毒以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；作载体构建的重组体导入受体细胞的过程； 转导转导 以以噬菌体噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。 感受态细胞感受态细胞 用特殊方法处理后，受体细胞才具备接受外源用

23、特殊方法处理后，受体细胞才具备接受外源DNA的的 能力，能力， 这种细胞称这种细胞称感受态细胞感受态细胞。 感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。 第59页/共77页 四、重组四、重组DNA的筛选与鉴定（的筛选与鉴定（筛筛） （筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法） 1） 平板筛选平板筛选 2） 限制酶切图谱筛选限制酶切图谱筛选 3） PCR筛选重组体筛选重组体 4） 原位杂交技术原位杂交技术 插入失活插入失活 蓝白筛选蓝白筛选 第60页/共77页 （一）（一） 平板筛选平板筛选 是指利用载体的遗传性标记直接

24、筛选的方法。 如，具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能 在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转 化的则不能生长。 1. 插入失活 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使 该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的 培养平板上。 第61页/共77页 抗生素平板筛选抗生素平板筛选（插入失活插入失活） 第62页/共77页 （2 2）蓝蓝- -白白筛选筛选 它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选 含有编码含有编码-半乳糖苷酶的基因。半乳糖苷酶的基因。 载体：载体：编码编码-半乳糖半乳糖 宿主：宿主： 编码编

25、码-半乳糖半乳糖 苷酶苷酶N端端序列序列 苷酶苷酶C C端端序列序列 - -互补互补 细菌表达：细菌表达： -半乳糖苷酶活性蛋白半乳糖苷酶活性蛋白 5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚（吲哚（ X-gal） 形成形成蓝色菌落蓝色菌落 当在质粒中插入外源当在质粒中插入外源DNA-DNA-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N N端基因失活端基因失活 不能与宿主不能与宿主-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端端进行进行-互补互补产生产生白色菌落白色菌落。 （IPTG 存在下）存在下） 第63页/共77页 蓝蓝白白筛选筛选示意图示意图 第64页/共77页 第65页/共77页 3. PCR3. PCR筛选重组体筛选重

26、组体 抽提少量重组抽提少量重组DNADNAPCRPCR扩增扩增电泳鉴定电泳鉴定序列分析。序列分析。 4. 4. 原位杂交技术原位杂交技术 第66页/共77页 第67页/共77页 一、疾病基因的发现一、疾病基因的发现 19901990年年美国科学家首先启动美国科学家首先启动人类基因组计划（人类基因组计划（ HGPHGP），），计划历时计划历时1515年，至年，至20052005年完成；年完成； 20012001年年2 2月月1212日日由由SinceSince和和NatureNature杂志同时向世界杂志同时向世界 宣布，人类基因组宣布，人类基因组3X103X109 9bpbp的最新图谱，约含的

27、最新图谱，约含3 3 4 4万个万个 基因；基因； 整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成 。但要揭示人类但要揭示人类4 4万个基因功能的任务将更为艰巨。万个基因功能的任务将更为艰巨。 第68页/共77页 人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因的人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因的 定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人类定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人类 疾病相关基因提供了参照模板。疾病相关基因提供了参照模板。 如，已知人类遗传性疾病约有如，已知人类遗传性疾病约有30003000种，推测可种，推测可 能是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致能是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致 。如果利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正。如果利用分子生物学技术，将