双缩脲法测定血清蛋白质含量—比色技术课件

1、双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 1 生物化学实验生物化学实验 CQMU 生物化学与分子生物学教研室 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 2 蛋白质的定量分析是生物化学和其他蛋白质的定量分析是生物化学和其他 生命学科最常涉及的分析内容，是临床上生命学科最常涉及的分析内容，是临床上 诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也 是许多生物制品，药物、食品质量检测的是许多生物制品，药物、食品质量检测的 重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋 白质进行准确可靠的定量

2、分析，则是经常白质进行准确可靠的定量分析，则是经常 进行的一项非常重要的工作。进行的一项非常重要的工作。 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 3 目前测定蛋白质含量的方法有很多种，目前测定蛋白质含量的方法有很多种， 下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些 蛋白质测定方法：蛋白质测定方法： 物理性质：紫外分光光度法。物理性质：紫外分光光度法。 化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、LowryLowry法法 染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。 其他性质：荧光法。其他

3、性质：荧光法。 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 4 p掌握双缩脲法测定蛋白质的原理掌握双缩脲法测定蛋白质的原理 p掌握分光光度计的使用掌握分光光度计的使用 p掌握标准曲线的制作掌握标准曲线的制作 p学习分光光度法测定的原理和方法学习分光光度法测定的原理和方法 实验目的实验目的 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 5 实验原理实验原理 p双缩脲反应（双缩脲反应（Biuret reaction） 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 6 p双缩脲法测定蛋白质的原理双缩脲法测定蛋白质的原理

4、蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（- - CO-NH-CO-NH-），同样），同样可以与碱性铜溶液中的可以与碱性铜溶液中的Cu2+ 发生双缩脲反应而生成紫红色的发生双缩脲反应而生成紫红色的Cu2+-蛋白质蛋白质 络合物。在一定范围内紫红色颜色的深浅与络合物。在一定范围内紫红色颜色的深浅与 蛋白质含量成正比，因此可以用分光光度法蛋白质含量成正比，因此可以用分光光度法 测定样品中蛋白质的含量。测定样品中蛋白质的含量。 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 7 方法学评价方法学评价 操作简便、迅速、受蛋白质性质的影响较小；操作简便、

5、迅速、受蛋白质性质的影响较小； 灵敏度较差，需要样本含蛋白质灵敏度较差，需要样本含蛋白质120 mg水水 平才能检测到；平才能检测到； 且特异性不高，除含且特异性不高，除含-CONH-的化合物有此反的化合物有此反 应外，凡是含应外，凡是含-CONH2、-CH2NH2 、 -CS-NH2 等基团的化合物也有此反应。等基团的化合物也有此反应。 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 8 p 分光光度法的基本原理分光光度法的基本原理 分光光度法是利用物质具有对光的选择性吸收特征分光光度法是利用物质具有对光的选择性吸收特征 而建立起来的一种定量、定性分析方法。而建立起来

6、的一种定量、定性分析方法。 当一束单色光通过均匀的溶液时，入射光强度为当一束单色光通过均匀的溶液时，入射光强度为I Io o，透射光，透射光 强度为强度为I It t。 。 I I0 0I It t b C C 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 9 透光率（透光率（TransmittanceTransmittance）T T：透射光的强度：透射光的强度I It t与入与入 射光强度射光强度I I0 0之比。之比。 T = It Io *100% 透光率愈大，溶液对光的吸收愈少；透光率愈小，溶液对透光率愈大，溶液对光的吸收愈少；透光率愈小，溶液对 光的吸收愈

7、多。光的吸收愈多。 吸光度（吸光度（AbsorbanceAbsorbance）A:A:透光率的负对数。透光率的负对数。 A = -T= It Io A A愈大，溶液对光的吸收愈多。愈大，溶液对光的吸收愈多。 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 10 pLambert-BeerLambert-Beer定律吸收光谱法基本定律定律吸收光谱法基本定律 描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。 含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓 度和液

8、层厚度成正比。度和液层厚度成正比。 A AKCL KCL A A为溶液对光的吸光度为溶液对光的吸光度，反映了物质对光的吸收程度；，反映了物质对光的吸收程度； K K为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度。 C C为溶液浓度为溶液浓度； L L为溶液厚度为溶液厚度； 实验中溶液厚度不变，则实验中溶液厚度不变，则A AKCKC 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 11 p分光光度法的基本应用分光光度法的基本应用 利用吸收光谱对物质进行定性分析利用吸收光谱对物质进行定性分析 利用

9、吸收光谱对物质进行定量分析利用吸收光谱对物质进行定量分析 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 12 原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物 质溶液的定性检测质溶液的定性检测 常用方法：常用方法： 比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线 不同，表明物质的化学结构不同。不同，表明物质的化学结构不同。 比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同；比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同； 化学结构相似的物质最大吸收波长相同，吸收系数不化学结构相似的物质

10、最大吸收波长相同，吸收系数不 同。同。 比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（DNA DNA A A260 260/A /A280 280=1.8 =1.8 纯度鉴定纯度鉴定) ) 利用吸收光谱对物质进行定性分析利用吸收光谱对物质进行定性分析 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 13 原理：原理： Lambert-BeerLambert-Beer定律定律 常用方法：常用方法： 标准曲线法标准曲线法 配制一系列已知不同浓度的标准溶液，用选定的显配制一系列已知不同浓度的标准溶液，用选定的显 色剂显色。选用合适波长的入射光

11、。测定时先以空白色剂显色。选用合适波长的入射光。测定时先以空白 溶液调节透光率溶液调节透光率100%100%，然后分别测定标准系列的吸光，然后分别测定标准系列的吸光 度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条 通过原点的直线，叫做标准曲线（或称通过原点的直线，叫做标准曲线（或称A-CA-C曲线）。曲线）。 利用吸收光谱对物质进行定量分析利用吸收光谱对物质进行定量分析 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 14 标准曲线标准曲线 标准曲线与样品的测定条件必须一致。标准曲线与样品的测定条件必须一致。 双缩脲法测定血

12、清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 15 常用方法：常用方法： 标准曲线法标准曲线法 标准管法：标准管法： 对个别样品进行测定，且对个别样品进行测定，且A-CA-C曲线线性良好直接曲线线性良好直接 比较测定结果。比较测定结果。 A A标标 =K=K标标c c标标b b标标 A A测测 =K=K测测 c c测测 b b测测 c c测测 =A=A测测 /A/A标标 c c标标 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 16 分光光度计的使用分光光度计的使用 分光光度计设计的原理分光光度计设计的原理 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质

13、含量比比 色技术色技术 17 分光光度计操作分光光度计操作 打开电源开关，使仪器预热打开电源开关，使仪器预热2020分钟分钟 用用“波长设置波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分按钮将波长设置在您将要使用的分 析波长位置上析波长位置上 打开样品室盖，按打开样品室盖，按“0%T0%T”键调透射比零键调透射比零 盖好样品室盖，按盖好样品室盖，按“100%T100%T”调调100%100%透射比透射比 按按“方式键方式键”（MODEMODE）将测试方式设置为吸光度方）将测试方式设置为吸光度方 式式(A)(A) 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 打开样品室盖，

14、将盛有溶液的比色皿分别插入比色打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色 皿槽中，盖上样品室盖皿槽中，盖上样品室盖 将参比溶液推入或拉入光路中，按将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T100%T”调零调零A A 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是 被测样品的吸光度参数被测样品的吸光度参数 实验完成后，关闭电源，实验完成后，关闭电源，洗净比色皿洗净比色皿，并盖好盖布。，并盖好盖布。 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 18 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 19

15、实验步骤实验步骤 p取试管取试管7支，按下表操作并记录：支，按下表操作并记录： 空白管空白管标准管标准管测定管测定管 蛋白质标准液蛋白质标准液 （1ml=10mg） 0.20.40.60.81.0 待测血清样本待测血清样本1.0 9g/L NaCl溶液溶液1.00.80.60.40.2 双缩脲试剂双缩脲试剂3.03.03.03.03.03.03.0 光吸收值光吸收值 混匀各管，室温放置混匀各管，室温放置30分钟。以空白管调零，在波分钟。以空白管调零，在波 长长540 nm比色，读取各管光吸收值，并记录。比色，读取各管光吸收值，并记录。 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比

16、色技术色技术 20 p在座标纸上以各管蛋白质含量为横座标，在座标纸上以各管蛋白质含量为横座标， 两管平均光吸收值为纵座标，绘制标准曲两管平均光吸收值为纵座标，绘制标准曲 线。线。 p以测定管的光吸收值在标准曲线中查出以测定管的光吸收值在标准曲线中查出 该待测血清样本的蛋白质含量。该待测血清样本的蛋白质含量。 p计算待测血清样本中蛋白质的浓度计算待测血清样本中蛋白质的浓度 （g/L）。）。 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 21 注意事项注意事项 p本实验是定量实验，要求所有玻璃仪器必须洁本实验是定量实验，要求所有玻璃仪器必须洁 净、干燥，蛋白质标准液和血清取量必须准确。净、干燥，蛋白质标准液和血清取量必须准确。 p双缩脲试剂应该在最后同时加入各个试管，以双缩脲试剂应该在最后同时加入各个试管，以 保证各管反应同时进行。保证各管反应同时进行。 p各管加好样后必须充分混匀。显色反应需要各管加好样后必须充分混匀。显色反应需要 2030 min才能完成，显色后放置才能完成，显色后放置4小时光吸小时光吸 收值稳定。收值稳定。 p注意分光光度计的正确使用。注意分光光度计的正确使用。 双缩脲法测定血清蛋白质含量双缩脲法测定血清蛋白质含量比比 色技术色技术 22 思考题思考题