生化第三版考研课件第14章核酸物理化学性质

1、生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 一、核酸的水解一、核酸的水解 酸、碱、酶水解酸、碱、酶水解 作用于磷酸二酯键和糖苷键作用于磷酸二酯键和糖苷键 DNA/RNA对酸对酸/ /碱的碱的有差别有差别 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 二、核酸的酸碱性质二、核酸的酸碱性质 具有芳香环结构特点具有芳香环结构特点 能发生酮式能发生酮式/ /烯醇式、氨式烯醇式、氨式/ /亚氨式互变亚氨式互变 嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性 _主要是环内氨基的贡献主要是环内氨基的贡献 1 1、碱基的解离、碱基的解离 生化第三版考研课件

2、第14章核酸物 理化学性质 O NH N H O O N- N H O CH3 O NH N H O CH3 O N- N H O 1 9.5pK 1 9.9pK H H O NH2 NH + N H O NH2 N N H O- NH2 N N H 2 12.5pK 1 4.6pK H H 胞嘧啶中胞嘧啶中 尿嘧啶及胸腺嘧啶中尿嘧啶及胸腺嘧啶中 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 N NH + NH N NH2 N N NH N NH2 N N N- N NH2 1 4.15pK H H 2 9.8pK N NH NH N H+ NH2 O N NH NH N NH2 O N N-

3、 NH N H+ NH2 O N N- N- N NH2 O H H H 1 3.2pK 2 9.6pK 3 12.4pK 鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到则结合到N7上上 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 2、核苷的解离、核苷的解离 戊糖可增强碱基的酸性解离戊糖可增强碱基的酸性解离 核糖中的羟基也可发生解离核糖中的羟基也可发生解离 3.3.核苷酸的解离核苷酸的解离 磷酸基使核苷酸具有很强的酸性磷酸基使核苷酸具有很强的酸性 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 ROH OH O O P RO- OH O O P RO- O- O O P 1 0.7 1.

4、6pK H H 2 5.96.5pK OH N - CH2 O O OH O OP OH N CH2 O OH N - CH2 O O O- O OP OH N CH2 O H 1 1.5pK 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 DNADNA等电点为等电点为4 44.54.5； RNARNA等电点为等电点为2 22.52.5 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收 碱基含有共轭双键碱基含有共轭双键 最大吸收峰最大吸收峰260nm左右左右 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔核酸溶液紫外吸收

5、以摩尔磷的吸光度表示，摩尔 磷即相当于摩尔核苷酸。磷即相当于摩尔核苷酸。 30.98A P WL （ ） ：摩尔吸光系数：摩尔吸光系数 A：吸收值：吸收值 W：每升溶液磷重量：每升溶液磷重量 L ：比色杯内径：比色杯内径 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 OD260的应用：的应用： 1. DNA或或RNA的定量的定量 OD260=1.0相当于相当于 50g/ml双链双链DNA 40g/ml单链单链DNA（或（或RNA） 20g/ml寡核苷酸寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度 DNA纯品纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品纯品: OD260/OD28

6、0 = 2.0 含杂蛋白及苯酚，降低含杂蛋白及苯酚，降低 3.判断判断DNA是否变性是否变性 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 四、核酸的变性、复性与杂交四、核酸的变性、复性与杂交 ( (一一) ) 核酸的核酸的变性变性（denaturation） 1 1、DNA的变性：的变性： 在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNA双链解双链解 开成两条单链的过程。开成两条单链的过程。 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力，某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力， 使核酸分子高级结构改变、理化性质及使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发

7、生改变。生物活性发生改变。 不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变 2 2、变性的实质、变性的实质 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 降解：核苷酸骨架上降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯键的断裂磷酸二酯键的断裂 DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 高温（一般高温（一般7575） 热变性热变性 强酸、碱强酸、碱 酸碱变性酸碱变性 甲醛甲醛（Agarose中中RNA ） 尿素尿素（PAGE中中DNA ） 3 3、变性因素、变性因素 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质

8、 OD OD260 260增高 增高 粘度下降粘度下降 比旋度下降比旋度下降 浮力密度升高浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变酸碱滴定曲线改变生物活性丧失生物活性丧失 4、变性后理化性质变化、变性后理化性质变化 RNA变性：从螺旋到线团之间的转变变性：从螺旋到线团之间的转变 RNA的变性引起的性质变化没有的变性引起的性质变化没有DNA明显明显 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 完全变性后核酸紫外吸收值增加：完全变性后核酸紫外吸收值增加： 天然天然DNA 2540%、RNA 约约1.1% 实质：碱基暴露实质：碱基暴露 由于变性或降解引起紫外吸收

9、增加的现由于变性或降解引起紫外吸收增加的现 象称增色效应象称增色效应 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 DNA变性变性 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 5、DNA热变性的特征热变性的特征 变性过程是变性过程是“跃变式跃变式”的，而非渐的，而非渐 变变 解链曲线：解链曲线：连续加热连续加热DNADNA，以温度对，以温度对 A A260 260作图，所得的曲线称为解链曲线 作图，所得的曲线称为解链曲线。 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 指增色效应达指增色效应达50%时的温度时的温度 一般一般DNA Tm 值在值在85 - 90 C之间之间 Tm：DNA变性时

10、，变性时，OD260达达 到最大值的到最大值的50%时的温度称时的温度称 为为DNA的解链温度或融解温的解链温度或融解温 度度(Tm)。 大小与大小与G+C含量成正比。含量成正比。 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 （1 1）DNA的均一性：的均一性： （2）GC含量：含量： 经验公式：经验公式： XG+C（Tm69.3）2.44 （3）介质中的离子强度：）介质中的离子强度： Tm值大小与下列因素有关：值大小与下列因素有关： 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 ( (二二) )核酸的核酸的复性复性（renaturation）

11、变性变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的在适当的条件下，两条彼此分开的 单链重新缔合成双链单链重新缔合成双链复性复性。 热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即可复性， 这一过程称为退火这一过程称为退火(annealing) 。 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 DNA复性复性 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 分子量越大复性越难；分子量越大复性越难； 浓度越大，复性越容易；浓度越大，复性越容易； DNA复性也与它本身组成和结构有关复性也与它本身组成和结构有关 （具有很多重复序列（具有很多重复序列DNA，复性快）。，复性快）。 减色效应（低色效应）减色效应（低色效应） 复性时紫外吸收减少的现象复性时紫外吸收减少的现象 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 ( (三三) ) 核酸的杂交核酸的杂交 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 生化第三版考研课件第14章核酸物 理化学性质 DNA-DNA 杂交双链分子杂交双链分子