银杏内酯B抑制oxLDL诱导脐静脉内皮细胞炎症损伤的分子机制研究

1、银杏内酯B抑制oxLDL诱导脐静脉内皮细胞炎症损伤的分子机制研究 北京中医药大学 硕士学位论文 银杏内酯B抑制ox-LDL诱导脐静脉内皮细胞炎症损伤的分子机制 研究 姓名：李睿 申请学位级别：硕士 专业：临床中药学 指导教师：李兴广 20070501 英文缩略语表 英文缩略语表 以英文字母为序 中文全称 缩略词 英文全称 APS ammonjumsulfate 过硫酸胺 per atherosclerosis 动脉粥样硬化 AS acid ASA 阿斯匹林 OAcetylsalicylic BSA bovinesenlmalb岫in 牛血清白蛋白 COX2 环氧化酶2 CycIoo ygena

2、se一2 diacetate DCFHDA2，7dichloronuorescin二氯荧光黄双乙酸盐 DMEMDulbeccosModifiedMediumDMEM培养基 Eagle 焦碳酸二乙脂 DMSO diethylpyrocarbonate DTT dithiotIlreitol 二硫苏糖醇 cen factor ECGF endothelial 内皮细胞生长因子 gmwth tetraceticacid EDTA 乙二胺四乙酸 ethylenediamine EGlA 乙二醇二乙醚二氨四乙酸 ethyleneglyc01bis一 2一aminoethyl tetra aceticac

3、id C FITC F1uorescence-isothio异硫氰酸荧光素C pallatc fctalbovinesemm 胎牛血清 FBS bitobn 银杏内酯B GB G撕kgo 四甲基乙二胺 HEPES N一2-hydroxyethyIpiperazineN ethanesulfbncacid humaIlumbilicalveinendothelialcells人脐静脉内皮细胞 HUVEC m01ecule-1细胞间粘附分子-1 intercellularadhesion ICAM1 Inhibitor-kB 抑制性kappaB蛋自 中文摘要 中文摘要 本文通过文献研究和实验研究两

4、部分来探讨银杏内酯B G加咖Zf如B， low GB 抑制氧化性低密度脂蛋白 oxidized densitylipoprotein，oxLDL 诱 导脐静脉内皮细胞炎症损伤的分子机制，对中医药防治动脉粥样硬化炎症反 应的机理揭示有重要的临床意义和理论价值。 文献研究 1中药银杏叶文献研究 银杏叶为银杏科银杏属植物的干燥叶，用作药物在我国已经有五千年的 历史。首载于本草品汇精要，书中记载银杏叶“归肺经，能敛肺平喘，益 心止痛”。从对历代文献的整理以及查阅中概括银杏叶的性味归经、功效主治 等，为本课题提供了理论依据。 2中药银杏叶近代化学和药理研究 中药银杏叶中含有多种化学成份，主要有24的黄酮

5、甙 flavonoid 由基、抗脂质过氧化等作用。而萜类化合物则为强效血小板活化因子 factor，PAF 受体拮抗剂，具有抑制血小板聚集， plateletactivating 抗血栓等作用。其中以银杏内酯B 以下简称GB 对PAF的拮抗性最强，具 有广泛的临床应用前景因而近几年倍受关注。 3有关动脉粥样硬化的研究 从分子生物学角度阐明动脉粥样硬化始动环节及其发生机理，明确其信 号转导通路中的若干重要环节，进而有针对性地选取实验指标。 4中医药对动脉粥样硬化的研究 从中医辩证论治的角度归纳动脉硬化的症型、病机、治则，并对近几年 内酯B抑制oxLDL诱导脐静脉内皮细胞炎症损伤分子机制的研究 用

6、于治疗动脉粥样硬化的药物进行简单综述。 实验研究 1GB抗氧化损伤作用： 方法：用DcFHDA荧光标记内皮细胞，流式细胞仪检测HuVEC内活性氧 reactive blot方法检测oxLDL oxygenspecies，ROS 的含量；用western 的氧化程度。 组比较基本相同，但大剂量GB 200ugm1 抑制作用不显著。活性氧测定表 明300ugm1oxLDL刺激细胞明显增加了细胞内ROS含量，GB剂量依赖性地 抑制oxLDL诱导的ROS产生。300gmloxLDL刺激内皮细胞使p38MAPK磷 酸化水平增加，300ugm1GB有效抑制了oxLDL诱导的p38姒PK磷酸化。 2GB抑制

7、炎症蛋白表达： blot方法检测oxLDL 方法：免疫荧光染色观察NFkB的活化。用western 诱导ICAMl和COX一2的表达以及IkB磷酸化的水平。 结果：荧光显微镜下观察细胞经oxLDL 1mgm1 刺激后，NFkB活化 进入到核内，GB 500ugm1 有效地抑制NFkB的活化。同样结果也可以间 酸化以及ICAM一1的表达，但对炎症蛋白cox一2没有抑制作用。 主题词：银杏内酯B、氧化型低密度脂蛋白、活性氧、炎症蛋白 ABSTRACT ABSTRACT aIId This consistsOftwO summarization experimental study pans：lit

8、eratllre will funherclillical scta foundationfor study，which application s仃ong summarization Literature 1 LiteratureresearchofGB inclinic leaf leafof 6玎D6口Landhasbeenused isthedried Gf行置gD Gf订置gD BPc口D foraboutfivethousand recordedin Pf砌删历九删D yearsIt聃郴firstly totreat thc chaIlnelaIldcan the whichsai

9、d：“GB to astringelungs belongslung a11dasthrnancanalso theheartandrelieVe reViewing cougll tonify painBy GBs literaturefromthe summarizednavour，cha衄elentered， pastdynasties，、e the aIldactionwhichof艳rthetheoreticalb觞isfor research distribution and researchofGB 2 The chemistrypharmacology chemical con

10、tains glycosides many compounds：24navonoid Gf七：leaf freeradicalsa11d aIld6 Flavanoidremoves a11tilipid terpenes mainly ofPAF孤d isaneffectiVe antagonist receptor peroxidationMeanwhile，terpenoid isthemost and can the coagulationGB suppressplateletaggregationpreVent aIldis usedinclinic allterpeneswidel

11、y effective枷Ong AS 3Researchabout w“h ASwas reviewed ThemechanismalldOnsetof molecul缸biology clearly transduction mainelememsinthe inorderto signal passageway identi句several werechosenasme which experimenta王foclls AS research ChineseMedicine 4Traditional regarding based willbetreated and The thefape

12、uticalprinciple syndrome，pathogenesis for used therecemmedication tfeating ondifferentiation0f syndrome，meaIlwhile 4 内酯B抑制oxLDL诱导脐静脉内皮细胞炎症损伤分子机制的研究 ASwillbesummarized Studies Experimental e仃ectOfGB oxidation 1The against protective The Methods：ROSwasmeasuredthenowof phosphorylation by cytometry LDL

13、inducedox?LDLwasdeterminedWestemblotOxidized of by by p38MAPK was TBARSeValuatiOn qualltifiedby thcoxidationofLDLThe Results：Asmalldoseof GB 25斗g11 iIlllibited theLDL ofMDAwasalmosttomatOf oxidative group，howeVer equal degree the effectROS and dosesofGBdidnthave inhibitory generationp38MAPK high sti

14、mulationwimoxLDL was increased蚯er individually phosphorylation 16hoursin 5hoursand HUVECGfn毫go，胁 oxLDL 1mgm1 for 300pgm1 for totlleconcemrationofdoseaIld Binhibitedthc ofROS productionaccording ma曲erJ phosphorylation p38MAPK Meanwhile，GB 300m1 iIlllibited effectively 2The effectofGBon innammatOrypro

15、tein inhibitoIy immuno?nuorescence activationofNF-kBwasdete皿ined Methods：The by of andCOX一2aswellas ofICAMl evaluationThe phosphorylation expression Westemblot IkBweredetemined by withthe with detected Results：Afterstimulation oxLDL 1mm1 、 l，e NF-kBenteredtheimranuclear mattheactivated nrescent port

16、ion microscope sameresultswere inhibitedtheactiVationThe GB 500“gIIll effectively tlle ofIkB confi吼ed tendency indirectlybyme鹪uring theincreaseofthe inhibited phosphorylation administratingoxLDL 1mm1 ，GB onCOX-2? hadno alld inllibitor ，effect ofICAM?l，but expression ofp38MAPK protein Key 文献综述 文献综述 1

17、中药银杏叶文献研究 6ff0施L的干燥叶，全 银杏叶，又名白果叶，为银杏科植物银杏G加置go 国大部分地区均有产，北自东北沈阳，南达广州，东起华东，西南至贵州、 云南均有栽培。野生种仅浙江天目山地区【l】。中国药典 2005年版 记载： 银杏叶，秋季叶尚绿时采收，及时干燥，入药时以新脱落的叶为佳。本品味 甘、苦、涩，性平，归心、肺、脾经。具敛肺，平喘，活血化瘀，止痛功效。 用于肺虚咳嗽、冠心病、心绞痛、高血脂等症【2】，本草品汇精要中也记载 银杏叶“归肺经，能敛肺平喘，益心止痛【3】”。现代医学认为银杏叶具有调节 脂代谢，降低胆固醇和甘油三酯作用，对冠心病、脑血栓等心脑血管疾病有 较好的疗效。

18、 银杏叶古已作药用，首载于本草品汇精要，书中记载银杏叶“归肺经， 能敛肺平喘，益心止痛”。且有“叶为末，和面作饼，煨熟食之【31，的记载。 汉拉英中药材正名词典将银杏叶作为药名，银杏作为植物名“。 本草纲目对银杏树的生长特性、银杏叶的形态进行了详尽的描述， 时珍日：“银杏生江南，以宣城者为胜。树高二、三丈。叶薄纵理，俨如鸭掌 形，有刻缺，面绿背淡。二月开花成簇，青白色，二更开花，随即卸落，人 罕见之其树耐久，肌理白腻。术家取刻符印，云能召使也【51。” 广西本草选编记载银杏叶“味苦、甘、涩，性平。小毒【61”，全国中 草药汇编中也有对银杏叶性味的描述：“微苦，平。” 植物名实图考日：“银杏一名

19、鸭脚子”其种仁、叶等作药用，全 国中草药汇编、中药大辞典等均有收载。本草药名汇考指出银杏叶“活 血止痛。主治冠状动脉硬化性心脏病心绞痛，血清胆固醇过高症，痢疾，象 8 内酯B抑制oxLDL诱导脐静脉内皮细胞炎症损伤分子机制的研究 皮肿【7】。” 我国自古以来，主用白果入药和食疗，在中药配方中有时用银杏叶代替。 治疗中枢外周血流紊乱和脑血管动脉粥样硬化等。目前，可以认为其具有“认 知增强”和“血管调节”两大作用。我国对银杏叶的开发利用始于60年代末， 在中药制荆中见有银杏叶片的方剂，主要是银杏叶的水或醇粗提物，主治高 血压、动脉粥样硬化和冠心病。 2中药银杏叶近代化学和药理研究 银杏叶中所含化学

20、成分相当复杂，分析测定银杏叶提取物中含有160多 种成份，主要成份为二萜内酯和黄酮苷及有机酸等。银杏叶提取物中主要含 有两类活性物质：黄酮苷类化合物 navonoid glycosides 和萜内酯类化 aIld bilobalides 合物。其中有效总黄酮占24，以槲皮素、山 ginkgolides 萘酚、异鼠李素及其甙类为主。萜类占6，以白果内酯、银杏内酯为主。白 果内酯属倍半萜内酯，是目前从银杏叶中发现的唯一的一个倍半萜内酯化合 物；银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯M、银杏内酯J均为二 萜内酯化合物，于1932年由Funlkaw首先从银杏叶中分离出来。黄酮类化合 物主要具有清

21、除自由基、抗脂质过氧化等作用，能够调节超氧化物歧化酶、 过氧化氢化酶，可预防和治疗与活性氧自由基有关的疾病。而萜类化合物则 为强效PAF拮抗剂，包括银杏苦内酯A、B、C、M、J、银杏新内酯和白果内 酯，其中银杏内酯B对PAF的拮抗性最强，具有抑制血小板聚集，抗血栓， 改善血液动力学与血液流变学，改善心脑代谢等作用。从本世纪20年代起， 银杏叶制剂就用于治疗外周及中枢血液循环障碍以及脑功能障碍等症。70年 代，德、法等国家将银杏叶提取物广泛应用于脑动脉硬化症等。同期，我国 也研制出银杏叶制剂舒血宁 6911片剂 ，用于治疗心绞痛等也取得了一定的 疗效。目前，银杏叶制剂已风靡于欧洲、亚洲和美洲等地

22、区。由于银杏具有 9 文献综述 独特的药理作用，其应用前途及其潜在的经济价值不可低估，前景广阔。 3有关动脉粥样硬化的研究 目前研究表明，动脉粥样硬化是一个多因素慢性炎症性疾病，涉及血管 内皮细胞、平滑肌细胞、单核巨噬细胞、血小板等功能变化等，其中血管内 皮细胞的损伤是动脉粥样硬化病变的始动因素。在正常生理情况下妞管内皮 结构完整、功能正常，一方面通过屏障作用阻止低密度脂蛋白 Iowdensity lipoprotein，LDL 等大分子物质和单核细胞等血液细胞的成分进入动脉内膜， 12，PGl2 等活性分子发挥抗凝、 另一方面又通过产生前列腺素 prostaglalldjn 抑制平滑肌细胞增

23、殖等多种功能。血液中大量LDL在内皮下沉积可以导致内 皮细胞的损伤，损伤后的血管内皮细胞分泌产生粘附分子，吸引单核细胞向 血管内皮下游走，衍变为巨噬细胞，吞噬脂质后成为泡沫细胞。泡沫细胞分 泌释放一系列细胞因子、生长因子及炎症介质，触发级联式炎症反应，可见 到局部炎症细胞浸润，血管平滑肌细胞增生。最终由于血管的炎症损伤，斑 块破裂，血小板与内皮细胞下胶原组织结合，导致血栓形成。因此，炎症损 伤是动脉粥样硬化的一个主要病理改变，是动脉粥样硬化发生和进展的根本 环节，在动脉粥样硬化研究中，如何抑制炎症损伤是目前的研究热点之一。 子，属于Rel family，由300个氨基酸组成，能与免疫球蛋白k轻

24、链基因的增 以同源或异源二聚体组成 p65 调控。在静息状态下与抑制性蛋白IkB结合存在于细胞浆呈无活性状态例。当 受到有关刺激时，由IkBkinase IKKc【，艮Y组成的复合物 特异性地使I膪磷 酸化，继而与NFkB解离。与I七B解离的NF，七B成为活化状态。活化的NFkB 二聚体 p50-p65 能够快速从细胞浆转移至细胞核，在核内与DNA靶基因 结合，启动转录相关的基因。 见下图 10 内醣B抑制。xLDL诱导脐静脉内痘细胞炎症掼伤分子机制的研究 NFkB活化的途径 文献综述 1996年Brand报告在动脉粥样硬化血管内膜的平滑肌细胞、巨噬细胞、 内皮细胞中发现活化的NFkB存在【9

25、1。许多研究已经证实NFkB活化是动脉 粥样硬化炎症损伤的中心环节，多种炎症基因的表达与NFkB活化相关。 NF硒可以作为一个基因开关，启动相关炎症基因的表达，包括粘附蛋白 chemo矾rac伽lt protein1 MCP1 等。这些炎症蛋白分子的产生，进而促进 炎症级联反应，加重动脉粥样硬化的炎症损伤o彤】。各种刺激包括1NF-a、 esters、H202等均可诱导NFkB活化。在动脉粥样硬化 interleukin1、phorbol 的早期过程中即可在成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞发现氧化型低密度 脂蛋白 oxidizedLDL，ox_LDL 诱导的NFkB活化。高脂饮食喂养的动物 模

26、型，其冠状动脉内皮细胞可以检测到活化的NFkB【14m1。这些事实均有力 地提示NFkB活化是动脉粥样硬化进程的一个重要环节。许多药物学家也将 NFkB作为一个药物靶点加以研究。 体内的活性氧由移行的炎性细胞和血管细胞产生。在正常生理情况下， ROs的产生通过抗氧化剂系统的作用保持平衡，这些抗氧化系统可清除ROS， 维持细胞氧化还原自稳态。当某些因素作用于细胞使这一稳态失调，R0s的 产生大于被清除的速率时，就会导致R0s的蓄积，产生氧化应激，损害血管 内皮细胞的功能，甚至导致细胞凋亡或坏死。NFkB是一个转录因子，其活化 受细胞氧化应激 oxidativestress 调控。活性氧 reac

27、t“eoxygenspecies， 是通过氧化机制促进内皮功能障碍和细胞死亡，刺激血管细胞敏感产生ROS， 促使NFkB活化。活性氧通过基因表达的长时程改变影响多种生物效应，这个 过程是由多条信号传递途径参与的。在多种情况下，蛋白质磷酸化是信号传 递至终端的重要方式，转录因子或与其相互作用的上游蛋白质分子常常是磷 酸化修饰的直接靶点，其中研究最多的是丝裂原活化蛋白激酶 12 内酯B抑制oxLDL诱导脐静脉内皮细胞炎症损伤分子机制的研究 kinase，MAPK 。MAPK是传递细胞外刺激到达细 mitogenactivatedprotein 胞核的一系列连续蛋白激酶级联反应中的最后环节，靶分子是

28、转录因子。大 量实验证明，活性氧引起的细胞氧化还原状态的改变可激活由不同MAPK家族 成员参与的信号传导通路。有学者报道，用产生过氧化物的因子LY83583处 亚油酸及其代谢产物等可引起血管功能障碍的物质均可通过使sMC产生活性 MAPK的快速磷酸化。NADPH 氧而激活MAPK，表现为p42，44MAPK和p38 氧化酶抑制剂和过氧化氢酶的过表达可阻断AngII参与的p38MAPK的磷酸化 【16-18】。上述结果说明，活性氧不仅可通过氧化细胞组分直接损伤细胞，而且 也可通过诱导炎症基因的表达使局部炎症反应加剧而间接损伤细胞。可见， 活性氧作为一种刺激因素可启动血管系统MAPK信号传导，从而

29、将细胞外刺激 信号和细胞内基因表达的改变及细胞功能相联系。 4中医药对动脉粥样硬化的研究 近十年来，整个世界特别是西方发达国家，掀起了一阵绿色浪潮 green wave ，其起因主要由于合成药物和抗生素的广泛使用，特别是其滥用和误用 能够对人体健康造成很大的损害，这就使人们形成了一种共识，即得自绿色 植物的药品往往具有较大的安全性。银杏作为近代植物药开发研究的热点之 一，正处于这一浪潮的前沿。祖国医学虽然没有动脉粥样硬化的病名，但根 据其临床表现和发病特点，一般学者常常归之于脾虚痰湿、肝肾亏虚、气滞 血瘀，即属本虚 肝、肾、脾不足 标实 痰湿、气滞血瘀 之病证。脾气 亏虚中焦失之健运则水谷不化

30、，聚湿生痰而为病：肝失疏泄一则使脾失健运， 二则气郁生热，炼津灼液为痰；肝阴不足，阴不制阳，易致肝阳上亢，而肾 水不足，水不涵木也致肝阳亢盛，肝肾阴亏日久必炼液为痰，凝血为瘀，脉 络枯涩从而发病【19】。中医治疗原则多为补其不足，泻其有余，一般归为健脾 益气、滋阴养血、补益肝肾以治其本，活血化瘀、软坚散结、通脉化浊以治 文献综述 其标。现代中医药防治动脉硬化多从调节血脂，抗脂质过氧化损伤，抗血栓 及调节PGl2TxA2，抑制平滑肌细胞增殖等方面入手。如：茵陈蒿降低高脂血 症模型小鼠血清总胆固醇和动脉硬化指数：当归注射液显著降低实验性高脂 血症家兔血清甘油三酯水平，减小主动脉斑块面积；银杏叶提取

31、物减少血浆 丙二醛 MDA 含量和增加一氧化氮 NO 水平，延缓饲胆固醇兔动脉粥样 硬化 AS 的形成：丹参素抑制二磷酸腺苷 ADP 诱发的血小板聚集，提 高血小板内环腺苷酸 cAMP 水平，抑制TxA2合成，等【201。其中，近几年 对银杏叶的研究较为多见。尽管一些研究结果己经显示GB在抑制动脉粥样硬 化炎症方面具有多种有益的生物学保护效应，但确切的分子机制还不清楚。 GB是否能作为动脉粥样硬化的防治药物也没有明确的定论。值得我们进一步 深入探讨的问题是，GB对动脉粥样硬化的保护作用除了抑制PAF外，是否还 有可能存在其他的机制，其作用是如何调控的，以及GB是否能够抑制oxLDL 诱导的NFkB活化以及炎症分子表达，目前对其抑制动脉粥样硬化炎症损伤 的有效浓度，特别是对氧化型脂质诱导动脉粥样硬化损伤的有效保护浓度是 多少尚缺乏了解。 14 内酯B抑