《蛋白激酶与磷酸酶》

1、蛋白激酶与磷酸酶蛋白激酶与磷酸酶 梅柱中梅柱中 病理生理学教研室病理生理学教研室 蛋白质翻译后修饰蛋白质翻译后修饰 Post-translational modifications (PTMs) 磷酸化修饰（Phosphorylation ） 糖基化修饰（Glycosylation ） 泛素化修饰（Ubiquitination ） 乙酰化修饰（Acetylation ） 甲基化修饰（Methylation ） SUMOylation 磷酸化修饰的氨基酸磷酸化修饰的氨基酸 蛋白质的磷酸化修饰蛋白质的磷酸化修饰 导致受体蛋白的 2% 蛋白质的磷酸化修饰发生在上； 大部分的是由介导 的（protei

2、n tyrosine kinase, PTKs)； Ser/Thr磷酸化修饰多发生于 蛋白激酶将ATP末端的磷酸基团转移到蛋白质侧 链的羟基上； 磷酸酶催化蛋白质侧链上磷酸基团的水解。 ProteinOH + ATPProteinOP O O O + ADP PiH2O Protein Kinase Protein Phosphatase 蛋白激酶与磷酸酶蛋白激酶与磷酸酶 30%的蛋白质可以发生磷酸化修饰的蛋白质可以发生磷酸化修饰 人类的激酶组包括人类的激酶组包括518蛋白激酶基因蛋白激酶基因 其中其中218个基因与人类疾病的发生发展密切相关个基因与人类疾病的发生发展密切相关 约约30个基因是

3、肿瘤抑制基因个基因是肿瘤抑制基因 约约100个为原癌基因个为原癌基因 Human Kinome 约占人类基因总数的约占人类基因总数的1.7% 蛋白激酶的结构蛋白激酶的结构 激酶结构域（Kinase domain） 调节结构域（Regulatory domain） 靶向性靶向性结构域（Targeting domain） 蛋白激酶的分类蛋白激酶的分类 酪氨酸蛋白激酶 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 (PKC,MAPK,Plk,Rho Kinases) 双特异性蛋白激酶 (MAPKK) 磷酯酰肌醇激酶 ( PI3K) 受体激酶 (EGFR,FGFR,PDGFR) 非受体激酶 (JAK,Src,Abl) 受体

4、酪氨酸激酶（受体酪氨酸激酶（RTK） 受体酪氨酸激酶包括，参与了 细胞的多种生命活动如细胞的生长、细胞形态与细胞 周期调控、基因的转录与细胞凋亡等； RTKs通常是，与 配基结合后发生，使细胞内的结构域靠近， 通过自磷酸化而激活； 该家族受体的激活。 Six subfamilies of receptor tyrosine kinases involved in cell growth and differentiation. Only one or two members of each subfamily are indicated. Note that the tyrosine kina

5、se domain is interrupted by a kinase insert region in some of the subfamilies. The functional significance of the cysteine-rich and immunoglobulin-like domains is unknown. 受体酪氨酸激酶（受体酪氨酸激酶（RTK） 受体二聚体化与激酶的激活受体二聚体化与激酶的激活 Binding of insulin to the alpha subunits causes the beta subunits to phosphorylate

6、 themselves (autophosphorylation), thus activating the catalytic activity of the receptor. 胰岛素受体胰岛素受体 MAPKK可同时催化MAPK激酶的T与Y的磷酸化 修饰： 磷酸化位点的三肽模体 TXY ERK TEY p38 TGY JNK TPY MAPK是通过是通过Thr和和Tyr的双位点同时磷酸的双位点同时磷酸 化而被激活。化而被激活。 双特异性蛋白激酶双特异性蛋白激酶 磷酸肌醇循环磷酸肌醇循环 PI PI-Phosphatase o o o o OH OH HO HO P PIP PI-Kinas

7、e phosphatidylinositolphosphoinositides o o o o OH HO P P 34 5 P P HO 磷酸肌醇循环磷酸肌醇循环 PI3K-PKB/Akt信号通路信号通路 Western blot analysis of whole cell lysates of Jurkat cells, with 0.1M calyculin A for 20 minutes prior to lysis, using Phospho-Thr antibody. + PPP inhibitor 蛋白激酶与磷酸酶蛋白激酶与磷酸酶 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶 (PP1, PP

8、2A)； 酪氨酸蛋白磷酸酶 (PTP1B)； 双特异性蛋白磷酸酶 (DUSP1)； 脂质磷酸酶 (PTEN, SHIP)。 蛋白质磷酸酶蛋白质磷酸酶 Ser/Thr与与Tyr蛋白磷酸酶蛋白磷酸酶 催化机制：催化机制： 含有双核的金属离子金属离子中心； 通过水分子水分子来进行亲核攻击； 磷酸基团不转移到磷酸酶不转移到磷酸酶上， 是一步催化反应。 结构上：结构上： 数量有限数量有限的催化亚基与众多调 节亚基配对。 没有金属离子的参与； 通过催化结构域的进 行亲核攻击； 形成磷酸基磷酸基- -酶中间体酶中间体，是二步催 化反应。 多基因家族，在单一磷酸酶中同时多基因家族，在单一磷酸酶中同时 含有催化

9、与调节结构域。含有催化与调节结构域。 Ser/Thr磷酸酶 (PP1) Tyr磷酸酶 (PTP, DUSP1) Fe O O H O P O-Ser-substrate Zn O H-His Ser/Thr蛋白磷酸酶催化模式图蛋白磷酸酶催化模式图 PP2A磷酸酶的多样性与复杂性磷酸酶的多样性与复杂性 翻译后修饰对磷酸酶功能的调控作用翻译后修饰对磷酸酶功能的调控作用 磷酸化修饰的级联反应磷酸化修饰的级联反应 Signal molecule Active protein kinase 1 Active protein kinase 2 Active protein kinase 3 Inactiv

10、e protein kinase 1 Inactive protein kinase 2 Inactive protein kinase 3 Inactive protein Active protein Cellular response Receptor P P P P P P ATP ADP ADP ADP ATP ATP PP PP PP Activated relay molecule A relay molecule activates protein kinase 1. 1 Active protein kinase 1 transfers a phosphate from AT

11、P to an inactive molecule of protein kinase 2, thus activating this second kinase. 2 Active protein kinase 2 then catalyzes the phos- phorylation (and activation) of protein kinase 3. 3 Finally, active protein kinase 3 phosphorylates a protein (pink) that brings about the cells response to the signa

12、l. 4 Enzymes called protein phosphatases (PP) catalyze the removal of the phosphate groups from the proteins, making them inactive and available for reuse. 5 i i i Phosphorylation cascade MAPK信号级联反应信号级联反应 Stimulus Growth factors, Mitogen, GPCR p38 MAPK Stress, GPCR, Inflammatory cytokines, Growth fa

13、ctors Stress, Growth factors, Mitogen, GPCR MEKK1, 4, MLK3, ASK1 MEKK2, 3, Tpl2 MLK3, TAK, DLK Raf, Mos, Tpl2 MKK3/6 MEK1/2 MKK4/7MEK5 ERK1/2 MAPKKK Growth, Differentiation, Development Inflammation, Apoptosis, Growth, Differentiation Growth, Differentiation, Development ERK5/BMK1JNK1,2,3 MAPKK MAPK

14、 Biological responses 磷酸酶的信号级联反应磷酸酶的信号级联反应 S287 S287 T138 T13814-3-3 14-3-3 During interphase, Cdc25 is held inactive via by inhibitory phosphorylation at Ser287 and 14-3-3 binding. Likewise, PP2A/B56 maintains Thr138 in the dephosphorylated state. At the G2/M transition, Cdc25 is activated in a ste

15、pwise fashion. First, Cdk2 phosphorylates Thr138 which triggers the release of 14-3-3. Phosphorylated keratin intermediate filaments assist in 14-3-3 removal from Cdc25 and Plx1 may also play a role in this process. Exposed Ser287 is then readily dephosphorylated by PP1, inducing the activation and

16、nuclear translocation of Cdc25 and dephosphorylation of Cdc2. Once activated, Cdc2/Cyclin B phosphorylates multiple sites on Cdc25, enhancing its activity and preventing inactivation. Cdc2/Cyclin B may also activate the MAP kinase cascade which can phosphorylate Cdc25 in a parallel positive feedback

17、 loop. 位点特异性的磷酸化修饰位点特异性的磷酸化修饰 Kinase: ATM, ATR, DNAPK, CK1, CK2, Chk1, Chk2, etc. 在正常细胞中发生磷酸化修饰，但在受到应激刺激 时发生去磷酸化； 磷酸化修饰降低其与Hdm2的结合，并促进与转录 共刺激分子的结合，但它们在细胞中的功能是冗余的； 磷酸化修饰可诱导其下游的促凋亡蛋白基因如p53AIP1 等的表达； UV诱导其磷酸化修饰，其功能与抑制UV诱导的皮肤癌 密切相关。 p5 3: 蛋白质的磷酸化修饰分析蛋白质的磷酸化修饰分析 生物质谱分析蛋白质的磷酸化修饰生物质谱分析蛋白质的磷酸化修饰 EEVAS*EPEEAAS*PTTPK EEVAS*EPEEAASPTTPK EEVASEPEEAASPTTPK y1-y5, M y6-y12, M+80 y13-y17,M+160 y1-y17, M y1-y12, M y13-y17,M+80 蛋白质的磷酸化修饰蛋白质的磷酸化修饰 IMAC: Immobilized Metal Affinity Chromatography 固定化 金属离子亲和性层析法 SIMAC: sequential elution fro