酶法分析(生科院2015)

1、 4.反应产物抑制反应产物抑制 SP S P 酶 尿酸的定量 尿酸 H2O O2 尿酸酶 尿囊酶CO2 H2O22 293nmor297nm 有特征吸收 通过测A293 or A297定量 A=A1 A2-A3+ 方法：取试管3支 酶对照底物对照反应 尿酸酶溶液 硼酸Buff 尿酸酶溶液 硼酸Buff 待测样品液待测样品液 1 23 室温放15min A1A2A3 羟基丙酮酸定量 可用两种酶：甘油酸脱氢酶（专一性强） 乳酸脱氢酶（丙酮酸干扰） 羟基丙酮酸 甘油酸脱氢酶 NADH+H + NAD+ D-甘油酸 羟基丙酮酸 乳酸脱氢酶 NADH+H + NAD+ L-甘油酸 方法： 羟基丙酮酸 N

2、ADH+H + A1 加入酶 充分反应后 A2 比色皿中反应测定 AA1A2 A340 加 酶 A 时 间 （ 分 ） 羟基丙酮酸定量羟基丙酮酸定量 可用两种酶：可用两种酶：甘油酸脱氢酶甘油酸脱氢酶（专一性强）（专一性强） 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶（丙酮酸干扰）（丙酮酸干扰） 例2 L-谷氨酸 + H2O 谷氨酸脱氢酶 NAD + NADH -酮戊二酸 + NH4+ 此反应平衡偏向左方.测定时需设法使反应平衡向右进行 克服的办法: 的定量测定(NADH生成量的测定) 用谷氨酸脱氢酶 L-谷氨酸 + 加肼,反应生成 -酮戊二酸可以和肼反应 生成腙,将生成物-酮戊二酸 除去. 提高NAD+的浓度 可偶

3、联心肌黄酶 方法: 1 2 3 空白管 + NAD(过量) 谷氨酸 酶 肼 + + NAD(过量) 谷氨酸 肼 加NAD后准确60分钟 测340nm吸附值 加NAD后准确60分钟 测340nm吸附值 A1 A2 A=A2-A1 根据NADH的吸附系数求得其量,即可求得L-谷氨酸的量 (二）和指示酶反应偶联的定量法 常用在下面两种情况 （1）S E 测指 E PB P1P2 （2）所用酶的专一性不高 SA SB SC E 测指 E S与P无法区分 PA PB PC 常用在下面两种情况常用在下面两种情况 指示酶反应 1.以脱氢酶为指示剂 测定酶反应：S E P1 测定酶反应的产物P1作为以NAD或

4、NADP为 辅酶的某一脱氢酶的底物，将两个酶促反应 相偶联。 指示酶反应：P1 P2 NAD NADP NADH NADPH 指示酶反应指示酶反应 1.以脱氢酶为指示剂以脱氢酶为指示剂 葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）定量 G-1-P G-6-P 变位酶 脱氢酶 NADP+NADPH+H + G-6-P 6GA 测定酶反应： 指示酶反应：P 方法：BuffNADP样品（G-1-P）脱氢酶 放5分钟 340nm测A1（清除试剂及样品中混入的G-6-P） 向混合液中加变位酶 放4分钟 340nm测A2 A2A1 代表了G G-1-P 例1 的量 A2-A1代表了代表了G-1-P的量的量 例2样品中同

5、时含有G和果糖,利用酶法分析测定G的量 (利用己糖激酶) 己糖激酶 G ATP G-6-P 果糖-6-P 果糖 己糖激酶 葡萄糖异构酶 指示反应: 脱氢酶 6GA NADP + NADPH ATP P G-6-P ( ) G-6-P G-6-P P 例2 样品中同时含有样品中同时含有G和果糖，利用酶法分析和果糖，利用酶法分析 测定测定G的量（利用己糖激酶的量（利用己糖激酶） 方法: Buff+NADP+样品(G,果糖)+G-6-P脱氢酶 放置一定时间 测定A1 向混合液中加入己糖激酶 测定A2 通过A2-A1可计算出G的量 (若需测定果糖的量可继续向下) 向混合液中加入葡萄糖异构酶 测定A3

6、通过A3-A2可计算出果糖的量 P 放置一定时间 放置一定时间 例例3在一个比色杯中同时定量丙酮酸，磷酸在一个比色杯中同时定量丙酮酸，磷酸 烯醇式丙酮酸和烯醇式丙酮酸和D-2-磷酸甘油酸磷酸甘油酸 例3在一个比色杯中同时定量丙酮酸,磷酸烯醇式丙酮 酸和D-2-磷酸甘油酸 测定: 偶联: 指示: D-2-磷酸甘油酸 (D-2PGA) 烯醇化酶 磷酸烯醇或丙酮酸(PEP) 磷酸烯醇或丙酮酸+ADP丙酮酸激酶丙酮酸+ADP 丙酮酸 乳酸脱氢酶 NADH+H + NAD + 乳酸 2.以脱氢酶以外的酶作为指示剂 过氧化物酶作为指示剂 H2O24-氨基安替比林酚 过氧化物酶 有色化合物 （醌亚胶色素）

7、270420nm 测定G的量 测定酶反应GH2OO2 G氧化酶 GAH2O2 （葡萄糖醛酸） 指示酶反应有色物 通过测定270420nm任一处的A的变化可定出G的量 + H2O24-氨基安替比林酚 过氧化物酶 2.以脱氢酶以外的酶作为指示剂以脱氢酶以外的酶作为指示剂 过氧化物酶作为指示剂过氧化物酶作为指示剂 492nm有强吸收有强吸收 例：例：L-谷氨酸的定量测定谷氨酸的定量测定 测定反应：测定反应：L-Glu + NAD + H2O 谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶 + -酮戊二酸酮戊二酸+ NADH + H + 指示反应：指示反应：NADH + INT + H 心肌黄酶心肌黄酶 NAD + 甲臜甲

8、臜 + NAD + 甲臜甲臜 心肌黄酶心肌黄酶+ 酶循环放大法的原理、步骤（超微量前列腺素的定量为例） （三步） 第一步：转换反应： PGNAD+ PG脱氢酶 1、5-脱羧-PGNADHH+ NADH转 NADH转 PG 可作循环底物 第二步：循环反应 -酮戊二酸 Glu脱氢酶 Glu NADH+H+NAD+ 3-甘油酸 甘油醛脱氢酶 甘油醛 NADH转Glu(或3- 甘油酸） n次循环 n P 3- P 3- P P 正比 酶循环放大法的原理、步骤酶循环放大法的原理、步骤 （超微量前列腺素的定量为例）（超微量前列腺素的定量为例） （三步）第一步：转换反应（三步）第一步：转换反应 酶循环放大法

9、的原理、步骤（超微量前列腺素的定量为例） （三步） 第一步：转换反应： PGNAD+ PG脱氢酶 1、5-脱羧-PGNADHH+ NADH转 NADH转 PG 可作循环底物 第二步：循环反应 -酮戊二酸 Glu脱氢酶 Glu NADH+H+NAD+ 3-甘油酸 甘油醛脱氢酶 甘油醛 NADH转Glu(或3- 甘油酸） n次循环 n P 3- P 3- P P 正比 第二步：循环反应第二步：循环反应 第三步：指示反应：利用终点法测第三步：指示反应：利用终点法测Glu（或（或3磷酸甘油酸）的量磷酸甘油酸）的量 如何测得循环数如何测得循环数n？ 用已知量的用已知量的NADH已知 已知作为 作为NAD

10、H转 转在相同条 在相同条 件下进行循环反应和指示反应件下进行循环反应和指示反应 NADH已知 已知=NADH指示指示/n n=NADH指示 指示/NADH已知已知 （即用已知量的（即用已知量的NADH已知 已知平行做循环反应，指 平行做循环反应，指 示反应）示反应） 在这种方法中应注意的几个问题：在这种方法中应注意的几个问题： 1.在进行循环反应之前，必须在进行循环反应之前，必须设法除去转换反应中剩余的辅酶设法除去转换反应中剩余的辅酶，在上例，在上例 中就是设法除去中就是设法除去NAD+ 除去的方式：除去的方式：NAD和和NADP的氧化型和还原型在不同的的氧化型和还原型在不同的pH值下其稳定

11、值下其稳定 性不同，可通过调节性不同，可通过调节pH来达到目的来达到目的 NAD+ NADP+ (氧化型氧化型) NADH NADPH(还原型还原型) pH2 （25） 1h稳定稳定 5min99.9%被破坏被破坏 pH13（60 ） 10min99.9%被破坏被破坏 1001h 仍稳定仍稳定 在这种方法中应注意的几个问题： 1、在进行循环反应之前，必须设法除去转换反应中剩余的 辅酶，在上面的例子中就是设法除去NAD + 除去的方式：NAD和NADP的氧化型和还原型在不同的 PH值下其稳定性不同，可通过调节PH来达到目的 NAD + NADP+（氧化型） NADH NADPH（还原型） PH2

12、（25摄氏度） PH13（60摄氏度） 1小时稳定5min99.9%被破坏 10分钟99.9%被破坏 100 1小时仍稳定 2、在循环反应中，底物（不是辅酶）需够量 循环反应： PbSb AB SaPa SaK SbK mEa mEb 3、要用已知量的循环底物（上例中NADH）平行做循环反应 和指示反应以求得循环数n 2.在循环反应在循环反应中中，底物（不是辅酶）需够量底物（不是辅酶）需够量 3.要用要用已知量的循环底物已知量的循环底物（上例中（上例中NADH）平行做循环反）平行做循环反 应和指示反应以求得循环数应和指示反应以求得循环数n 循 环 反 应 SaPa Ea Eb A B PbSb

13、 AB Ea Eb Sa Sb Pa Pb NAD + 醇 脱 氢 酶 （ ADH） 苹 果 酸 脱 氢 酶 （ M DH） 乙 醇 草 酰 乙 酸 乙 醛 苹 果 酸 NADH 6G脱 氢 酶 （ G6PDH） 谷 氨 酸 脱 氢 酶 （ GDH） 6G 谷 氨 酸 NADP + NADPH P P -酮 戊 二 酸 6G PA CoASH CH3C O CoA 转 乙 酰 基 酶 （ PTA） 柠 檬 酸 合 成 酶 （ CS） 乙 酰 磷 酸 草 酰 乙 酸 磷 酸 柠 檬 酸 P 单酶循环 1、CoA循环： 丙二酸 丙二酸脱羧酶（MD） 乙酰CoA丙二酰CoA 乙酸CO2 MD + 2

14、、NAD循环： 脱氢表雄酮 3，17B羟-固醇脱氢酶 雄烯-3-17-二酮 NADH NAD 3，17B羟-固醇脱氢酶 睾酮5- + 单酶循环单酶循环 （二）应用范围 1、有循环底物参加的酶反应的底物或酶可测定 NAD、NADP、CoA等 2、能与以上反应偶联的酶反应的底物或酶可测定 如： G+ATP G-6-P+ADP G-6-P G6PDH NADP+ NADPH G醛酸-6-P 己糖激酶（HK） +H+ 可测G、可测ATP、也可测HK （二）应用范围（二）应用范围 1.有循环底物参加的酶反应的底物或酶可有循环底物参加的酶反应的底物或酶可 测定测定NAD、NADP、CoA等等 2. 能与以上反应偶联的酶反应的底物或酶能与以上反应偶联的酶反应的底物或酶 可测定可测定 辅酶的测定 （2、3-DPG）定量 3- P 甘油酸 P P P P P 甘油酸变位酶 2、3-二 P 甘油酸 2- P 甘油酸 FMN（黄素嘌呤单核苷酸） FAD（黄素嘌呤二核苷酸） TPP（焦磷酸硫胺） 乳酸氧化酶 氨基酸氧化酶 丙酮酸脱羟酶 P P P P P P P P P P 吡哆醛 吡哆胺 谷草转氨酶 D-2、3-二磷酸甘油酸例 辅酶的测定辅酶的测定 E P 抑制剂抑制剂 抑