第15章 分离分析法导论

1、1 fundamental of chromatograph analysis 2 第一节概述第一节概述 n通常将先分离后分析先分离后分析的仪器分析方法称为分离 分析法； n试样中组分性能上的差异性能上的差异：吸附、分配、交换、 迁移速率等。 n包括色谱（气相色谱气相色谱、高效液相色谱高效液相色谱）、高效 毛细管电泳法、色谱-质谱联用法等。 3 色谱法的特点色谱法的特点 （1 1）分离效率高分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。 （2 2）灵敏度高灵敏度高 可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。 （3 3）分析速度快分析速度快 一般在几分钟

2、或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 （4 4）应用范围广应用范围广 气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。 不足之处：不足之处： 被分离组分的定性较为困难。 4 第二节第二节 色谱分析法及其基本概念色谱分析法及其基本概念 一一. .色谱分析法简介色谱分析法简介 固定相固定相； 流动相流动相。 5 色谱法色谱法 当混合物随流动相流经色谱柱时，就会与固定相当混合物随流动相流经色谱柱时，就会与固定相发生作用发生作用， 由于各组分性质结构上的由于各组分性质结构上的差异差异，与固定间发生作用力的大小、强，与固定间发生作用力的大小、强 弱不

3、同，使得各组分被固定相弱不同，使得各组分被固定相保留时间保留时间不同，从而按一定次序由不同，从而按一定次序由 固定相中流出。固定相中流出。 与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测；与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测； 两相两相及及两相的相对运动两相的相对运动构成了色谱法的基础。构成了色谱法的基础。 6 二二. .色谱法分类色谱法分类 (1)(1)气相色谱气相色谱：流动相为流动相为气体气体（称为（称为载气载气）。）。 按按分离柱分离柱不同可分为：不同可分为：填充柱色谱填充柱色谱和和毛细管柱色谱毛细管柱色谱； 按按固定相固定相的不同又分为：的不同又分为：气固

4、色谱气固色谱和和气液色谱气液色谱 7 液相色谱液相色谱 (2)(2)液相色谱液相色谱：流动相为流动相为液体液体（也称为淋洗液）。（也称为淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。 8 (3)(3)其他色谱方法其他色谱方法 薄层薄层色谱和色谱和纸纸色谱：色谱： 比较简单的色谱方法。比较简单的色谱方法。 凝胶凝胶色谱法色谱法： 超临界超临界色谱色谱: : CO2流动相。流动相。 高效毛细管高效毛细管电泳电泳: : 九十年代快速发展、特九十年代快速发展、特 别适合生物试样分析分离的别适合生物试样分析分离的 高效分析仪器。高效分析仪器。 9 三、色谱流

5、出曲线与术语三、色谱流出曲线与术语 1.1.色谱图色谱图 无试样通过检测器时，检无试样通过检测器时，检 测到的信号即为基线。色谱分测到的信号即为基线。色谱分 析时，混合物中各组分经色谱析时，混合物中各组分经色谱 柱分离后，随流动相依次流出柱分离后，随流动相依次流出 色谱柱，经检测器把各组分的色谱柱，经检测器把各组分的 浓度信号转变成电信号，再记浓度信号转变成电信号，再记 录下来。录下来。 色谱图即检测器产生的信色谱图即检测器产生的信 号强度对时间号强度对时间t 作的图。作的图。 10 2.2.基线基线 无试样通过检测器时，检无试样通过检测器时，检 测到的信号即为基线。测到的信号即为基线。 3.

6、3.峰高、峰宽及面积峰高、峰宽及面积 11 4.4.色谱保留值色谱保留值 是色谱定性分析的依据。是色谱定性分析的依据。 两套参数：两套参数：时间时间/体积体积 （1）时间表示的保留值）时间表示的保留值 保留时间（保留时间（tR）：）：组分组分 从进样到柱后出现浓度极大值时从进样到柱后出现浓度极大值时 所需的时间；所需的时间； 死时间（死时间（t ）： ）：不能被不能被 固定相滞留的组分，从进样到出固定相滞留的组分，从进样到出 现峰最大值所需的时间现峰最大值所需的时间； 调整保留时间调整保留时间（tR）：）： tR= tRtM 12 （2）体积表示的保留值）体积表示的保留值 保留体积（保留体积（

7、VR）：）： VR = tRF0 F0为柱出口处的载气流量，为柱出口处的载气流量， 单位：单位：m L / min。 死体积（死体积（VM）：）： VM = tM F0 调整保留体积调整保留体积(VR)： V R = VR VM 13 （3） 相对保留值相对保留值2,1 组分组分2与组分与组分1调整保留值之比：调整保留值之比： r21 = t R2 / t R1= V R2 / V R1 相对保留值只与柱温相对保留值只与柱温 和固定相性质有关，与其和固定相性质有关，与其 他色谱操作条件无关，它他色谱操作条件无关，它 表示了固定相对这两种组表示了固定相对这两种组 分的选择性。分的选择性。 14

8、1. 1. 气相色谱分离过程气相色谱分离过程 当试样由载气携带进入色当试样由载气携带进入色 谱柱与固定相接触时，被固定谱柱与固定相接触时，被固定 相溶解或吸附相溶解或吸附; ; 随着载气的不断通入，被随着载气的不断通入，被 溶解或吸附的组分又从固定相溶解或吸附的组分又从固定相 中挥发或脱附中挥发或脱附; ; 挥发或脱附下的组分随着挥发或脱附下的组分随着 载气向前移动时又再次被固定载气向前移动时又再次被固定 相溶解或吸附相溶解或吸附; ; 随着载气的流动，溶解、随着载气的流动，溶解、 挥发，或吸附、脱附的过程反挥发，或吸附、脱附的过程反 复地进行。复地进行。 四、色谱分离过程四、色谱分离过程 1

9、5 2. 2. 分配系数分配系数（ partion factor） K 组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、 挥发的过程叫做挥发的过程叫做分配过程分配过程。在一定温度下，组分在两相间。在一定温度下，组分在两相间 分配达到平衡时的浓度（单位：分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，）比，称为分配系数， 用用K 表示，即：表示，即： M s c c K 组分在流动相中的浓度组分在流动相中的浓度 组分在固定相中的浓度组分在固定相中的浓度 16 3.3.分配比分配比 （partion radio）k 在实际工作中，也常用分

10、配比来表征色谱分配平在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平 衡过程。分配比是指在一定温度下，组分在两相间衡过程。分配比是指在一定温度下，组分在两相间 分配达到平衡时的质量比：分配达到平衡时的质量比： M s m m k 组组分分在在流流动动相相中中的的质质量量 组组分分在在固固定定相相中中的的质质量量 分配比也称：分配比也称： 容量因子容量因子(capacity factor)；容量比；容量比(capacity factor)； 17 4. 保留比保留比Rs与分配比与分配比k的关系的关系 u u R S S k m m mm m RS 1 1 1 1 M s Ms s 若组分和流动相通过长

11、度为若组分和流动相通过长度为L的分离柱，需要的时间分别为的分离柱，需要的时间分别为tR和和tM，则：，则： u L t u L t M S R ; 由以上各式，可得：由以上各式，可得： tR = tM(1+k) M R M MR t t t tt k 18 第三节色谱分析的基本理论第三节色谱分析的基本理论 色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动 力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效 与分离度的评价指标及其关系。与分离度的评价指标及其关系。 组分保留时间为何不同？色谱峰为

12、何变宽？组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？ 组分保留时间组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；：色谱过程的热力学因素控制； （组分和固定液的结构和性质）（组分和固定液的结构和性质） 色谱峰变宽色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；：色谱过程的动力学因素控制； （两相中的运动阻力，扩散）（两相中的运动阻力，扩散） 两种色谱理论：两种色谱理论：塔板理论塔板理论和和速率理论速率理论； 19 一、基本理论一、基本理论 1.1.塔板理论塔板理论（plate theory） - 柱分离效能指标柱分离效能指标 是一种半经验理论是一种半经验理论； 20 2. 2. 速率方程（也称范速率方程（也称范. .

13、弟姆特方程式）弟姆特方程式） -影响影响 柱效的因素柱效的因素 H = A + B/u + Cu H：理论塔板高度；：理论塔板高度； u：载气的线速度：载气的线速度(cm/s)； A：涡流扩散项；：涡流扩散项； B/u：分子纵向扩散项：分子纵向扩散项 Cu：传质阻力项。：传质阻力项。 减小减小A、B、C三项可提高柱效；存在着最佳流速。三项可提高柱效；存在着最佳流速。 A、B、C三项各与哪些因素有关？三项各与哪些因素有关？ 21 A. 涡流扩散项 n原因：组分碰到固定相颗粒，形成垂直方向“涡流”； n结果：导致到达检测器有先有后，色谱峰形变宽； n改善：提高固定相的颗粒细度和均匀性及填充均匀性

14、（与流动相性质、流动相速率无关）； n注：主要描述液相色谱， n对于空心毛细管柱，A=0 22 B/u 分子扩散项 n原因：组分在柱子中的浓度梯度差浓度梯度差； n结果：组分分子不能同时到达检测器，峰形变 宽； n改善：高流速载气，较低柱温，相对分子量较 大的气体作载气。 n注：主要描述气相色谱，且气细管柱大于填充 柱。 23 Cu 传质阻力项 n组分在气相和液相两相间进行反复分配时，遇到阻组分在气相和液相两相间进行反复分配时，遇到阻 力。力。 n传质阻力包括传质阻力包括流动相传质阻力流动相传质阻力Cm和和固定相传质阻力固定相传质阻力 Cs，液相传质阻力大于气相传质阻力。，液相传质阻力大于气相

15、传质阻力。 n即：即： C =（Cm + Cs） 24 3. 3. 载气流速与柱效载气流速与柱效- -最佳流速（气相色谱）最佳流速（气相色谱） C B A2 载气流速高时：载气流速高时： 传质阻力项是影响柱效传质阻力项是影响柱效 的主要因素，的主要因素，流速流速 ，柱效，柱效 , , 右图曲线的右边。右图曲线的右边。 载气流速低时：载气流速低时： H - u曲线与最佳流速：曲线与最佳流速： 由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影 响使得存在着一个响使得存在着一个最佳流速最佳流速值（即以塔板高度值（即以塔板高度H H对应载气流速对应载气流

16、速 u u作图，曲线最低点的流速即为作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。）最佳流速。） 分子扩散项成为影响柱效的分子扩散项成为影响柱效的 主要因素，主要因素，流速流速 ，柱效，柱效 ， 右图曲线的左边。右图曲线的左边。 C B u最佳= H最小= 25 4. 速率理论的要点速率理论的要点 (1) (1)组分分子在柱内运行的组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散多路径与涡流扩散、浓度梯度所、浓度梯度所 造成的造成的分子扩散分子扩散及及传质阻力传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬使气液两相间的分配平衡不能瞬 间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原

17、因。 (2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载 气流速可提高柱效。气流速可提高柱效。 (3) (3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。 阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。 (4) 各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影 响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使 柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的柱

18、效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的 影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。 26 三、三、分离度分离度 又称分辨率，为相邻两色谱峰的保留值之差与两峰又称分辨率，为相邻两色谱峰的保留值之差与两峰 宽度总和的一半的比值。宽度总和的一半的比值。 塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。 即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的

19、综合影响： 保留值之差保留值之差色谱过程的热力学因素；色谱过程的热力学因素； 区域宽度区域宽度色谱过程的动力学因素。色谱过程的动力学因素。 色谱分离中的四种情况如图所示：色谱分离中的四种情况如图所示： 27 讨论：讨论： 色谱分离中的四种情况的讨论：色谱分离中的四种情况的讨论： 柱效较高，柱效较高，K(分配系数分配系数)较大较大,完全分离；完全分离； K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离； 柱效较低，柱效较低，K较大较大,但分离的不好；但分离的不好； K小，柱效低，分离效果更差。小，柱效低，分离效果更差。 28 一、色谱定性鉴定方法一、色谱定

20、性鉴定方法 利用保留值定性利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保通过对比试样中具有与纯物质相同保 留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中 的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。 利用加入法定性利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分将纯物质加入到试样中，观察各组分 色谱峰的相对变化。色谱峰的相对变化。 29 又称又称Kovats指数指数()，它采用一系列物质来作为定性的参照，是一，它采用一系列物质来作为定性的参照，是一 种重现性较好的定性参数。种重现性较

21、好的定性参数。 测定方法：测定方法： 30 3.与其他分析仪器联用的定性方法 Sampl e Sampl e Gas Chromatograph (GC) Mass Spectrometer (MS) Separatio n Identificatio n 31 二、二、 色谱定量分析方法色谱定量分析方法 （1）峰高）峰高（h）乘半峰宽乘半峰宽（Y1/2）法：法：近似将色谱峰当作等 腰三角形。此法算出的面积是实际峰面积的0.94倍： A = 1.064 hY1/2 （2）峰高乘平均峰宽法）峰高乘平均峰宽法：当峰形不对称时，可在峰高0.15 和0.85处分别测定峰宽，由下式计算峰面积： A =

22、h（Y 0.15 + Y 0.85 ）/ 2 （3）峰高乘保留时间法）峰高乘保留时间法：在一定操作条件下，同系物的半 峰宽与保留时间成正比，对于难于测量半峰宽的窄峰、重叠 峰（未完全重叠），可用此法测定峰面积： A = hbtR （4）自动积分和微机处理法）自动积分和微机处理法 32 2. 校正因子 试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即： m i = fi Ai 绝对校正因子绝对校正因子：比例系数f i ，单位面积对应的物质量： f i =m i / Ai 定量校正因子与检测器响应值成倒数关系： f i = 1 / Si 相对校正因子相对校正因子：f i 即组分的绝对校正