高通量测序在临床精准诊断中的应用

1、高通量测序（高通量测序（NGSNGS）在临床）在临床 精准诊断中的应用精准诊断中的应用 高尚先先 研究员 博导 中国食品药品检定研究院 高通量测序成本迅速下降 第一次人类基因 组测序耗时13年， 成本30亿美元， 到2008年11月， 基因组测序仅需 一两周，花费10 万美元。新一代 仪器可将全基因 组序列测序成本 降到1000美元 以下，成本不足 第一代的百万分 之一。而且随着 技术进步，仍在 不断下降。 成本快速下降，测序领域的超摩尔定律助推临床应用 测序设备发展现状测序设备发展现状 3 第一代（稳定需求）第一代（稳定需求） ABi 3130 xL(FDA CFDA) 3730 xL 35

2、00 xL（FDA CFDA） 第三代第三代 Life Technologies (ABi) Ion Torrent PGM Helicos Biosciences Helicos Genetic Analysis System Pacific Biosciences RSSystem 第二代（高速发展）第二代（高速发展） Roche Genome Sequencer FLX System GS Junior System Illumina Genome Analyzer IIx MiSeq HiSeq 1000 HiSeq 2000 HiSeq 2500 Life Technologies

3、(ABi) 5500 SOLiD System 5500 xL SOLiD System DanaherMotion Polonator G.007 Complete Genomics 无锡艾吉因生物信息技术有限公司无锡艾吉因生物信息技术有限公司 AG-100 深圳华因康基因科技有限公司（深圳华因康基因科技有限公司（CFDACFDA） Pstar-1 中科院北京基因组所中科院北京基因组所/半导体所半导体所 BIGIS-1 BIGIS-4 各类高通量测序技术原理各类高通量测序技术原理 高通量测序技术在临床中的主要应用范围高通量测序技术在临床中的主要应用范围 出生缺陷相关分子诊断中的应用 无创产前

4、检测领域中的应用（NIPT） 染色体畸变检测领域中的应用（CNV-seq） 胚胎植入前遗传学筛查领域中的应用（PGS） 肿瘤相关分子诊断中的应用 遗传性肿瘤突变检测（Germ line） 肿瘤组织体细胞突变检测（Somatic） 液态活检（Liquid Biopsy） 出生缺陷防治，任重而道远。出生缺陷防治，任重而道远。 “ 据估计，目前我国出生缺陷发生率在5.6%左右,每年新增出生缺陷数约90万例。出生 缺陷不仅影响儿童的生命健康和生活质量，而且影响整个国家人口素质和人力资源的健 康存量，影响经济社会的健康可持续发展。” 中国出生缺陷防治报告（2012） 新生儿2000万 出生缺陷婴儿100

5、万 6 染色体疾病 10 单基因疾病 3040 多基因疾病 11 智力障碍 2030 各种畸形 染色体核型发病率 唐氏综合征47，+211/700 爱德华氏综合 征 47，+181/3000 帕陶氏综合征47，+131/10000 特纳综合征45，XO1/3000活产 女婴 克氏综合症47，XXY1/1000活产 男婴 出生缺陷分为染色体疾病、单基因和多基因疾病 NGS在无创产前检测领域中的应用（NIPT） NIPTNIPT的科学基础的科学基础 血浆游离胎盘血浆游离胎盘DNADNA 胎儿游离DNA：cell-free fetal DNA（cffDNA）Lancet.1997 胎盘来源 母体外周

6、血含有的 cffDNA，几乎全部来源 于胎盘滋养层细胞。 检出时限 怀孕4周可检出，8周后 含量上升并稳定存在。 1 2 无创取样 - 抽血 孕周范围广 12周到26周 质控容易 不依赖孕妇年龄孕周等因素、容易建立标准实验规范 不受上一胎影响 NIPTNIPT相较临床常见产前检测技术的优势相较临床常见产前检测技术的优势 检测技术 检测孕周描述 血清学筛查（唐氏筛查） 10-12周； 16周左右 5%的假阳性率；20%-40%漏诊率 绒毛膜取样 10-13+6周 侵入性；有一定的流产风险 羊水穿刺 16-20+6周侵入性；有一定的流产风险 脐静脉血穿刺 20-28周侵入性 ；有一定的流产风险 无

7、创DNA产前检测（NIPT） 12-26周非侵入性，安全；准确率99%以上 多国出台多国出台NIPTNIPT指南指南 国际专业协会发表NIPT指导意见 美国妇产科医师学会（ ACOG）和美国母 胎医学会（SMFM） 美国遗传学咨询协会（NSGC） 国际妇产科超声协会（ISUOG） 国际产前诊断协会（ISPD） 加拿大妇产科医师协会（SOGC） 美国医学遗传学及基因组学学院（ACMG） 意大利母胎医学协会 美国都是CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendments）认证机制， 无FDA批准公司 ACAOG 20150626 2015.1.15 卫计委妇

8、幼司卫计委妇幼司 我国我国NIPTNIPT临床应用政策法规临床应用政策法规 目的：目的： 完善技术规范 明确在孕产妇人群中的适用 范围 界定其在整体产前筛查与诊 断服务体系中的合理定位 规范服务流程 提高服务质量和管理水平 高通量基因测序产前筛查与 诊断技术规范（试行） NIPTNIPT的临床质量控制的临床质量控制 21三体综合征99% 18三体综合征97% 13三体综合征90% 检出率 复合假阳性率不高于0.5% 假阳性率 复合阳性预测值不低于50% 阳性预测值 复合假阴性率约为0.3% 假阴性率 胎盘/胎儿染色体结构差异 （也叫局限性胎盘嵌合， cpm）现象是由于发育造成 的，机制主要是受

9、精卵发 育早期的染色体纠正，在 正常孕妇群体里发生率约 千分之1-5，是nipt假阳性 发生的主要原因。这种现 象在生殖领域（pgs）也存 在，具体指囊胚活检样本 与其内细胞团染色体结构 不一致，发生比例要比孕 期cpm高，大概1-10%，因 为研究难度较大，具体数 字还没有共识。 NIPTNIPT的未来发展空间大的未来发展空间大 测 序 深 度 染色体非整倍体 唐氏综合征、爱德华氏综合征、等 染色体微缺失微重复综合征 Digeorge综合征、猫叫综合征、等 单基因病 耳聋、地中海贫血、苯丙酮尿症、等 AAGCTTGC GACTTCAGTT AGCGCTAAGC CAGTGCAT G NGS在

10、染色体畸变检测领域中的应用（CNV-seq） CNV-SeqCNV-Seq应用领域应用领域 流产原因查找 产前（羊水、脐血）检测 不孕不育原因查找 染色体疾病先证者的染色体异常检测 CNV-SeqCNV-Seq技术操作流程技术操作流程 CNV-SeqCNV-Seq针对的人群针对的人群 产前诊断： 具有染色体疾病家族病史的夫妇 死胎、反复性流产，需要查明原因的夫妇 曾经生育有出生缺陷患儿的孕妇 染色体核型分析结果为正常，但超声显示结构异常的胎儿及其父母 胎儿宫内发育迟缓 先证者遗传病诊断： 染色体核型分析正常，但临床表现为发育迟缓、智力低下、自闭、各种畸形、生育障 碍等的患者及其父母 其他医学检

11、测为染色体疾病，需要确诊的患者 NGS在胚胎植入前遗传学筛查中的应用（PGS) PGSPGS临床流程临床流程 检测内容：检测内容： 全部染色体非整倍体 大于4Mb的新发的染色体微缺失/微重复 大于1Mb的遗传自父母的染色体微缺失/微重复 使用使用范围范围: : 高龄患者（35岁） 有反复流产史的患者（自然流产3次） 反复胚胎种植失败的患者（失败3次） 生育过染色体异常患儿的夫妇 自身染色体数目或结构异常的夫妇 严重的男性不育（SMF），少弱精子症、畸精症 自愿接受胚胎染色体异常排查的夫妇 PGS检测内容及适用范围 对对NGSNGS在在PGSPGS应用的思考应用的思考 高灵敏NGS技术的测序环境

12、防污染系统的建立 单细胞测序 操作者脱落细胞的污染？ 样本与植入物的一致性问题 胎盘/胎儿染色体结构差异（也叫局限性胎盘嵌合，cpm）现象在生殖 领域（PGS）也存在，具体指囊胚活检样本与其内细胞团染色体结构不 一致，发生比例大概1-10%，因为研究难度较大，具体数字还没有共识。 注册审批的难度 1)国家标准物质研制 2)临床试验的难点? NGSNGS在肿瘤分子诊断中的应用在肿瘤分子诊断中的应用 *每10万人发病人数 *每10万人死亡人数 数据来源：全国肿瘤登记中心的2012中国肿瘤登记年报 前十大肿瘤发病占肿瘤整体发病比例76.39% 前十大肿瘤死亡占肿瘤整体发病比例84.27% 发病率*

13、每年新发3,120,000人 死亡率* 每年死亡2,700,000人 肺癌，54人 胃癌，36人 结直肠癌，29人 肝癌，29人 食管癌，22人 乳腺癌，21人 胰腺癌，7人 淋巴癌，7人 膀胱癌，7人 甲状腺癌，7人 肺癌，46人 肝癌，26人 胃癌，26人 食管癌，17人 结直肠癌，14人 胰腺癌，7人 乳腺癌，5人 白血病，4人 脑癌，4人 淋巴癌，4人 多种临床肿瘤分子诊断需求多种临床肿瘤分子诊断需求 全面的基因检测 多种样本类型 可进行疗效监测 靶向用药相关基因 化疗用药相关基因 肿瘤易感性相关基因检测 肿瘤发生相关基因检测 血液样本 小标本组织样本 大标本组织样本 准确定量 遗传性

14、肿瘤突变检测（遗传性肿瘤突变检测（GermGerm lineline） 临床应用：临床应用： 检测多种肿瘤的患病风险； 检测肿瘤基因型，判定家系成员患病风险； 指导肿瘤个性化治疗。 科研应用科研应用 快速、低成本的探索肿瘤相关基因的突变； 若采用毛细管测序的技术，一次只能检测一条DNA片段，需要 大量人力，成本高，且需要大量DNA样本。、 茱莉 BRCA1阳性 针对肿瘤基因外显子或SNP多态性位点进行NGS检测。 肿瘤组织体细胞突变检测（肿瘤组织体细胞突变检测（SomaticSomatic） 肺癌肺癌 Lung 结肠癌结肠癌 Colon 黑色素瘤黑色素瘤 Melanoma 胃癌胃癌 Gastr

15、ic 卵巢癌卵巢癌 Ovarian EGFRKRASKRASBRAFBRAFKITKITPDGFRA AKT1PIK3CAAKT1PIK3CAGNAQKRASAKT1FGFR2AKT1ERBB2 ALKPTENAPCPTENMAP2K1NRASPIK3CAp53PTENp53 BRAFp53CTNNB1SRCPIK3CAPTEN CTNNB1MAP2K1EGFRp53 METNRASFBXW7MET NRAS Industry Guidelines Emerging and Clinical Trials 指导肿瘤的个体化治疗 很多肿瘤患者无法进行活检或手术；很多肿瘤患者无法进行活检或手术；

16、穿刺受检者严重不适感；穿刺受检者严重不适感； 穿刺自身的临床风险；穿刺自身的临床风险； 取材时间点受限，很难进行多次取样；取材时间点受限，很难进行多次取样； 肿瘤异质性。肿瘤异质性。 基于组织的肿瘤体细胞突变检测的局限性基于组织的肿瘤体细胞突变检测的局限性 液态活检液态活检(Liquid Biopsy)(Liquid Biopsy) Speicher M R, Pantel K. Tumor signatures in the bloodJ. Nature biotechnology, 2014, 32(5): 441-443. 循环肿瘤细胞循环肿瘤细胞 (Circulating tumor

17、cells, CTCs)(Circulating tumor cells, CTCs) 游离肿瘤游离肿瘤DNA (Circulating tumor DNA, ctDNA)DNA (Circulating tumor DNA, ctDNA) 目前看，目前看，ctDNActDNA更适合做液态活检更适合做液态活检 作为无法获取组织标本 的补充，无创取样后的 检测结果指导临床用药 实现实时动态监测， 预测耐药及复发 提高全程管理水平 指导用药指导用药实时监测实时监测 循环而匀质的血液标本， 在一定程度有效克服异 质性 匀质标本匀质标本 未来可用未来可用ctDNA血液检测血液检测 进行突变状态的动态耐

18、药复发监测进行突变状态的动态耐药复发监测 肿瘤类型繁多，分子突变特点不一；肿瘤类型繁多，分子突变特点不一； 高灵敏度定性、定量检测，技术分辨率要求高；高灵敏度定性、定量检测，技术分辨率要求高； ctDNActDNA来源复杂，不同肿瘤患者个体差异较大，数据解读与注释来源复杂，不同肿瘤患者个体差异较大，数据解读与注释 需谨慎；需谨慎； 目前仍局限于晚期肿瘤的临床应用；目前仍局限于晚期肿瘤的临床应用； 需要大规模、多中心临床验证数据。需要大规模、多中心临床验证数据。 ctDNActDNA检测技术面临的挑战检测技术面临的挑战 对对NGSNGS在肿瘤应用的思考在肿瘤应用的思考 肿瘤风险易感基因检测对诊断的价值？ 数据库的积累？预测的精准性？ 23and me？2013年11月26日，FDA叫停 健康基因检测服务。 2015年3月：批准其布卢姆综合症基因携带者检测