流式细胞术原理及与肿瘤学的相关应用

1、流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） 流式细胞术是应用流式细胞仪对悬浮液中的细胞或 细胞器进行快速测量和多参数检测的细胞分析技术 ，是上世纪70年代在单细胞分析和分选基础上发展 起来的对细胞理化特性，诸如大小、DNA、RNA 、蛋白质、抗原等进行快速测量并分类收集的高科 技技术。它综合了激光技术，计算机技术，流体力 学，细胞化学，单克隆抗体，荧光化学，分子生物 学等各门学科，在对细胞群体的亚群进行定量分析 时，具有其它手段无法比拟的优越性。 临床型 光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握 科研型 同时配备多种波长的激光器，并可快速的将感兴趣的细胞分 选到特定的培养孔

2、上，适用于广泛且灵活的科研应用 流式细胞仪基本组成结构 1.流动室和液流系统 （流动室和液流驱动系统） 2.光学系统 （激光光源和光束形成、收集系统） 3.数据处理系统 喷嘴喷嘴 液液鞘鞘 流动室内充满了鞘液，鞘液的作 用是将样品流环包，鞘液流是一 种稳定的液体流动，鞘液以匀速 运动流过流动室，在整个系统运 行中流速是不变的，样品流在鞘 液的环包下形成流体力学聚焦， 使样品流不会脱离液流的轴线方 向，并且保证每个细胞通过激光 照射区的时间相等，从而得到准 确的细胞荧光信息。 流式细胞仪光信号 1、散射光信号：FSC和SSC 前向散射光信号(FSC)：与激光束方向同轴的称前向散射光 信号，反映细

3、胞大小 激光器激光器 激光器激光器 接收器接收器 大颗粒大颗粒 小颗粒小颗粒 侧向散射光信号(SSC)：与激光束方向垂直的称为侧 向散射光信号，主要反映了细胞的内部结构，内 部结构越复杂，SSC信号越强，反映细胞内颗粒性 。 激光器激光器 接收器接收器 散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染 色），因此称为细胞的物理参数。 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数 分析； 可检测的样本种类多样(单细胞悬浊液) - (1)外周血，骨髓，细针穿刺液，洗脱液，实体组织，培 养细胞 - (2)血清、血浆、细胞裂解液 流式细胞仪特点及检测标本 样品制备 1、新鲜或冰冻实体组织：酶消化法、机械法、化

4、学试剂处理法等。 剪碎法：取新鲜或冰冻（浸泡于生理盐水中）实 体组织0.5cm3，眼科手术剪剪碎，加入生理盐水 ，300目尼龙膜过滤，200ml离心5min，生理盐水 洗涤二次。 注意事项：由于各种实体组织成份、特性各不相 同，对不同的实体组织必须采用不同的单细胞分 散方法，才能使单细胞产量高，细胞损伤小。 2、石蜡包埋组织：扩大了FCM分析应用范围，并 可以对大量临床随访病例资料进行重新研究与利 用。标体制备：二甲苯脱蜡法组织清洁剂脱 蜡法甲酸双氧水处理法。 注意事项：脱蜡完全：检验方法 加入100%乙 醇，如果无絮状物浮起，即可视为脱净，反之则 没有脱净。掌握消化时间，避免细胞核消化掉 。

5、切片薄厚适宜，过薄组织碎片多，过厚不宜 脱蜡。 3、骨髓、血液及体液：去除红细胞及浓缩有核细 胞。骨髓及血液：淋巴细胞分离液体液：一 般需经300ml离心5min，PBS洗涤二次。 如体液 中红细胞太多，可用溶血素去除红细胞。 注意事项：每次同时制备对照血液淋巴细胞标 本，作为二倍体细胞外参标准。视标本中有核 细胞浓度的高低进行调整，一般细胞浓度调至 510X109/L。 荧光染色 PBS洗细胞12次 加（荧光）单抗，暗处孵育1530分钟 PBS洗细胞一次 过300目尼龙网 上机检测 通过DNA检测进行细胞周期分析 细胞周期：G0、G1、S、G2 、M 细胞周期中DNA含量：G0/G1-2C（

6、二倍体） S期-2C 4C、G2/M-4C（四倍体） 流式细胞周期与DNA倍体分析的 基本原理 4CM期： 细胞分裂期 4CG2期：DNA合成后期 2C-4CS期： DNA合成期 2CG1期：DNA合成前期 2CG0期：DNA合成静止期 DNA倍体细胞周期： FCM分析细胞周期的基本方法 DNA荧光染料特异性与细胞DNA结合 DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧 光强度与DNA所吸收荧光分子多少成正比。 最常用的荧光染料：碘化丙啶（PI） DNA含量的表示 细胞群的DNA含量在FCM中一般以DNA指数（DNA index ，DI)表示相对含量，一个正常的二倍体细胞峰，其G0/G1 期细

7、胞DNA含量为2C，DI值为1.0。 DI=（样本G0/G1期细胞峰平均荧光道数）/（正常二倍体 标准细胞G0/G1期细胞峰平均荧光道数） DNA倍体的判定标准 二倍体的DI为1.0，四倍体的DI为2.0。 变异系数（CV）：标准细胞CV 3%，新鲜组织 标本CV5%。 对于一个正常人体的二倍体细胞群，G0/G1期占 85-90%以上，S+G2M细胞占10-15%以下。 以二倍体参考细胞G0/G1期细胞DNA含 量定为2C值DI=1.0，基于标准二倍体 细胞的CV在5%以下，即判定标准： DNA二倍体=2C+2CV，DNA异倍体不 等于2C+2CV。 1. DI = 1.0 0.1 (0.91

8、.10) 为二倍体。 2. DI = 1.0 0.15 (0.851.15) 为近二倍体。 3. DI = 2.0 0.1 (1.902.10) 为四倍体。 4. DI 2.10为多倍体 5. 其余DI均为异倍体。 FCM分析在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中 的应用 DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志，有助于 癌变的早期诊断。 淋巴瘤在病理形态学还不能作出诊断前，FCM倍体 分析可以提供准确的诊断信息。 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性肿瘤对待。 形态学表现为良性的肿瘤出现非整倍体提示有恶 变的可能。 DI可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标 FCM分析DNA含量和DNA倍体的预后 意义 通常认

9、为DNA含量高，非整倍体的肿瘤恶性程度 高，预后差，二倍体或近二倍体肿瘤预后好。 除DI及倍体外，反映肿瘤细胞增殖状态的S期细胞 比例也被作为判断预后的指标。 FCM分析在肿瘤脱落细胞学检查中的应用 (1)发现DNA非整倍体细胞峰诊断为癌。 (2)如无明显的非整倍体细胞峰，但有一个突出的四 倍体细胞峰和15%的超二倍体细胞（S期细胞） ，并伴有G0/G1峰的CV 9%，诊断为癌。 (3)无明显的非整倍体细胞峰，但G0/G1峰CV值增大 ，并伴有10%15%超二倍体细胞和一个突出的 四倍体峰，诊断为可疑癌。 为治疗方案和药理学研究提供依据 不同类型的肿瘤对化疗药物的敏感性不同。 可利用FCM进行

10、细胞周期分析，适当选择周期特 异性药物或非周期特异性药物。 MDR是由多药耐药基因编码的P糖蛋白（P- gp）亲脂化合物，包括多种抗癌药物和荧光染料 的跨膜性排出泵。从人淋巴细胞排除荧光染料与 细胞内P-gp的含量直接相关。当淋巴细胞出现 MDR阳性细胞时，患者对化疗药物开始出现耐药 性，需要考虑其他治疗方式。 FCM可精确定量DNA含量,能对早期癌变的 检出、癌前病变及病变的性质、癌变的发展 趋势、化疗指导以及预后评估做出判断 临床型 光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握 散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染 色），因此称为细胞的物理参数。 通过DNA检测进行细胞周期分析 细胞周期：G0、G1、S、G2 、M 细胞周期中DNA含量：G0/G1-2C（二倍体） S期-2C 4C、G2/M-4C（四倍体） 流式细胞周期与DNA倍体分析的 基本原理 FCM分析细胞周期的基本方法 DNA荧光染料特异性与细胞DNA结合 DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧 光强度与DNA所吸收荧光分子多少